流动注射化学发光法测定阿昔洛韦和更昔洛韦

　　【摘要】 目的 确定以Ce(IV)罗丹明B体系测定制剂中阿昔洛韦和更昔洛韦的流动注射化学发光(FICL)分析方法。方法 硫酸介质中Ce(IV)与阿昔洛韦/更昔洛韦发生氧化还原反应而产生化学发光，罗丹明B可显著增强其发光信号，且增敏效果与阿昔洛韦/更昔洛韦浓度呈一定的线性关系。据此，建立了测定注射剂中阿昔洛韦和更昔洛韦的流动注射化学发光新方法。结果 阿昔洛韦在3.0×10-5g/L-7.0×10-2g/L范围内呈线性关系，检出限为1.56×10-5g/L;更昔洛韦在5.0×10-5g/L-7.0×10-2g/L范围内呈线性关系，检出限为2.35×10-5g/L。通过对质量浓度为1.0×10-3g/L的阿昔洛韦和更昔洛韦分别进行的11次平行测定，其相对标准偏差(RSD)分别为2.08%和2.83%。结论 该方法线性范围宽、灵敏度高，简便快速，也是目前首次采用流动注射化学发光法对更昔洛韦含量的测定。

　　【关键词】 流动注射;化学发光;Ce (IV);罗丹明B;阿昔洛韦;更昔洛韦

　　Determination of acyclovir and gancyclovir usingflowinjection chemiluminescence methodMunira

　　Abudukere　mu, Wang Nannan, Tang Yuhai, Mhetaer Tuerhong

　　1. Department of Life Science, Kashi Normal College, Kashi 844007;

　　2. Institute of Analytical Sciences, Depatment of Science,

　　Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To develop a new flowinjection chemiluminescence (FICL) method for the determination of acyclovir and gancyclovir by using the CL system of Ce (IV)Rhodamine B. Methods The redoxreaction of Ce (IV) and acyclovir/gancyclovir in H2SO4 medium could generate CL signal. Rhodamine B could obviously sensitize this signal, and the CL intensity was proportional to the concentration of acyclovir and gancyclovir. Therefore, a new FICL method has been described for the determination of acyclovir and gancyclovir. Results For acyclovir, the determination range was 3.0×10-5g/L-7.0×10-2g/L, with 1.56×10-5g/L as its determination limit. During 11 repeated measurements for 1.0×10-3g/L acyclovir, the relative standard deviation was 2.08%. For ganciclovir, the determination range was 5.0×10-5g/L-7.0×10-2g/L, with 2.35×10-5g/L as its determination limit. The relative standard deviation was 2.83%, with 11 repeated measurements of 1.0×10-3g/L ganciclovir. Conclusion This method has broad linear range, high sensitivity, and convenience and speediness, it therefore, can be successfully used to determine the content of ganciclovir in injections.

　　KEY WORDS: flowinjection; chemiluminescence; Ce (IV); rhodamine B; acyclovir; gancyclovir

　　阿昔洛韦是目前国内外广泛使用的具有高度选择性和较低毒性的抗病毒药物。它对Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(AZV)有效，而对EB病毒及巨细胞病毒作用较弱。更昔洛韦是继阿昔洛韦之后开发的广谱抗病毒药，其抗病毒特异性强，起效快，适用范围广，也是第一个治疗人体巨细胞病毒感染的有效药物。更昔洛韦的化学结构与阿昔洛韦相似，在体内可被转化为三磷酸更昔洛韦，通过竞争性抑制三磷酸脱氧鸟苷嵌入延伸的病毒DNA，从而抑制单纯疱疹病毒与巨细胞病毒的DNA聚合酶，抑制病毒DNA合成[1]。目前，测定更昔洛韦含量的方法主要有：高效液相色谱法[24]、荧光法[56]、光谱法[78]、电化学方法[11]、高效毛细管电泳法[12]及化学发光法[1415]等。本文采用Ce(IV)罗丹明B体系建立了测定阿昔洛韦和更昔洛韦含量的流动注射化学发光新方法，较以上方法灵敏度高、线性范围宽而且简便快速，并可成功用于制剂中阿昔洛韦和更昔洛韦含量的分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要仪器

　　IFFLDD流动注射化学发光仪(西安瑞迈电子科技有限公司)。

　　1.2 分析用溶液

　　实验所用试剂均为分析纯，水为重蒸水。

　　1.2.1 阿昔洛韦及更昔洛韦标准品溶液的配制

　　分别精密称取阿昔洛韦及更昔洛韦标准品(中国药品及生物制品检验所提供)0.1000g，采用0.1mol/L NaOH稀释后定容至100mL，即得标准品储备液1.0g/L。

　　1.2.2 实验储备液的配制

　　硫酸铈铵溶液(0.1mol/L)依据中国药典配制：称取硫酸铈胺粉末7g，置于烧杯中，加入含有硫酸2.8mL的水50mL，加热使其溶解，放冷后转移入100mL容量瓶中，稀释定容。

　　罗丹明B储备液(0.01mol/L)：称取0.5g罗丹明B粉末，置于烧杯中，加水溶解，再转移入100mL容量瓶中定容。

　　供试品的配制：阿昔洛韦注射剂(规格：250mg/支)、阿昔洛韦滴眼液(规格：8mg/支)及更昔洛韦注射剂(规格：250mg/支)均购于陕西省广济大药房。注射样品的制备：分别取上述注射剂10支，各自混合均匀，分别取1支的量，适量蒸馏水稀释为药物含量相当于1.0g/L的样品溶液，于冰箱中冷藏;阿昔洛韦滴眼液样品的制备：取阿昔洛韦滴眼液10支，混合均匀，取1支的量，适量蒸馏水稀释成相当于含药物1.0g/L的样品溶液，于冰箱中冷藏。分析时各取上述相应储备液适量，稀释到线性范围内，即可。

　　1.3 实验流路图

　　阿昔洛韦及更昔洛韦的流动注射—化学发光反应装置如图1所示：流路a用于输送Ce(Ⅳ)溶液，流路b用于输送样品溶液，流路c用于输送罗丹明B溶液，样品溶液和罗丹明B溶液经由支路b和c，通过蠕动泵2(P2)进入流路(流速由P2控制)，在流入六通阀(V)前两者在三叉管中混合;同时Ce(Ⅳ)溶液经由流路a，通过蠕动泵1(P1)进入流路(流速由P1控制);之后，上述所有溶液均由六通阀注入，溶液混合后立即流入光度测定仪，光电倍增管检测所产生的光信号，实验参数由IFFLDD型流动注射化学发光仪设定。选择负高压为-600V，流速为1.80mL/min。工作站记录发光响应信号，以相对峰高进行定量。

　　1.4 实验条件的选择

　　由于阿昔洛韦和更昔洛韦具有相似的结构特征，故在实验中选择阿昔洛韦标准溶液作为研究对象优化实验条件。

　　1.4.1 酸性介质的选择

　　实验分别考察了多种酸性介质：HClO4、HCl、HNO3以及H2SO4对Ce (IV)罗丹明B阿昔洛韦化学发光体系相对化学发光信号强度的影响。结果表明，在H2SO4介质中化学发光强度最大且信号最稳定，故选择H2SO4作为该反应的反应介质。在H2SO4浓度为0.01-0.1mol/L范围内，化学发光信号强度随着其浓度的增大而显著增大;当浓度超过0.1mol/L时，发光信号增大得极其缓慢(如图2)。考虑到硫酸对仪器的强烈腐蚀，实验选择硫酸的浓度为0.1mol/L。

　　1.4.2 流路及流路参数的选择

　　考察了Ce(IV)、罗丹明B及阿昔洛韦的不同混合方式对化学发光强度的影响，只有将Ce(IV)注入罗丹明B和样品的混合溶液中时，体系发光信号基线稳定、信噪比高、重现性好。故采用该流路作为实验流路。之后，考察了流速对体系发光信号强度及信号稳定性的影响，实验发现当三条支路流速均为1.80mL/min时，体系的发光信号稳定且信噪比最高，故选择1.80mL/min作为反应流速。

　　1.4.3 Ce(IV)浓度的选择

　　考察了不同浓度的Ce(IV)所对应的相对化学发光强度，当Ce(IV)浓度低于0.01mol/L时，体系的发光强度随Ce(IV)的浓度增加而显著增大，而后其浓度的增大引起的发光强度增大幅度较为缓慢并最终逐渐变小(如图3)。故选择Ce(IV)浓度为0.01mol/L。

　　2 结 果

　　2.1 工作曲线、精密度及检出限

　　在选定的实验条件下，阿昔洛韦在3.0×10-5g/L-7.0×10-2g/L范围内其浓度与相对发光强度呈线性关系，检出限为1.56×10-5g/L;更昔洛韦在5.0×10-5g/L-7.0×10-2g/L范围内有线性关系，检出限为2.35×10-5g/L。通过对质量浓度为1.0×10-3g/L的阿昔洛韦和更昔洛韦分别进行11次平行测定，其相对标准偏差(RSD)分别为2.08%和2.83%。为了提高测定的精密度和准确度，工作曲线按阿昔洛韦和更昔洛韦的质量浓度数量级分段绘制，基本参数列于表1。表1 阿昔洛韦和更昔洛韦的线性参数(略)

　　2.2 干扰实验

　　对于1.0×10-3 g/L的阿昔洛韦溶液，当相对误差≤±5%时，1000倍的K+、Mg2+、Ba2+、Ca2+、NO-3;100倍的Zn2+、Al3+以及50倍的CO2-3、Cl-的存在对测定不造成干扰。从干扰实验结果来看，注射剂及滴眼液中常用的添加剂不干扰本化学发光体系对阿昔洛韦及更昔洛韦的测定。

　　2.3 加样回收实验

　　分别在3.0×10-3g/L的阿昔洛韦注射剂、阿昔洛韦滴眼液和更昔洛韦注射剂样品中加入高、中、低三个浓度的样品溶液，测定其相对化学发光信号强度并带入标准曲线得到测得值。分别计算回收率及平均回收率。实验结果见表2。表2 加样回收实验结果(略)

　　2.4 样品测定

　　分别精密吸取上述阿昔洛韦和更昔洛韦样品储备液适量稀释至标准曲线线性范围内，按图1所示流路进行化学发光分析并与药典方法做对比，实验结果见表3。表3 制剂中阿昔洛韦和更昔洛韦的含量测定(略)

　　3 讨 论

　　在硫酸酸性环境中，罗丹明B对硫酸铈—阿昔洛韦/更昔洛韦化学发光体系有一定的增敏作用，且体系的相对化学发光信号强度与阿昔洛韦和更昔洛韦的浓度在一定浓度范围内呈线性关系。因此，结合流动注射技术，建立了测定制剂中阿昔洛韦和更昔洛韦的流动注射化学发光新方法。该方法与目前测定阿昔洛韦和更昔洛韦含量的分析方法[34,8,12]相比具有线性范围宽、灵敏度高、仪器简单、操作简便及分析速度快等优点;与已有的测定阿昔洛韦含量的化学发光分析方法比较检出限更低，灵敏度高。同时，也是目前首次采用流动注射化学发光方法对更昔洛韦的含量进行的测定。

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