错配修复基因hMSH2在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

　　【摘要】 目的 通过观察错配修复基因hMSH2在膀胱移行细胞癌中的表达，探讨hMSH2与膀胱移行细胞癌的关系。方法 通过免疫组化方法测定hMSH2在80例膀胱移行细胞癌中及20例正常膀胱组织中的表达。结果hMSH2在膀胱移行细胞癌中的低表达率(26.25%)明显高于在正常膀胱组织中的低表达率(0)，有统计学意义(P<0.05)，且hMSH2在膀胱移行细胞癌中的低表达与肿瘤的分期分级有关(P<0.05)。结论 hMSH2的低表达与膀胱移行细胞癌的发生有关，与肿瘤的高分期和高分级有关，hMSH2的低表达在浸润性及分化差的膀胱移行细胞癌多见。

　　【关键词】 错配修复基因;膀胱移行细胞癌;免疫组化

　　hMSH2 Expression in Transitional Cell Carcinoma of Bladder

　　JIA Zhaohui,DOU Zhongling,LIU Hui

　　(First Affiliated Hospital，Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

　　Abstract:Objective To study the expressions and their significance of DNA mismatch repair gene hMSH2 protein in transitional cell carcinoma of bladder. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of hMSH2 in 80 cases of transitional cell carcinoma of bladder, in 20 cases with no carcinomas. Results Reduced expression rate of hMSH2 in transitional cell carcinoma of bladder was 26.25%,significantly higher than that in control group(P<0.05). It was also correlated to differentiation degree and clinical stage (P<0.05). Conclusion Reduced expression of hMSH2 may play an important role in carcinogenesis and development of transitional cell carcinoma of bladder.

　　Key words:hMSH2;transitional cell carcinoma of bladder;immunohistochemistry

　　膀胱肿瘤占泌尿系统肿瘤第1位，大量研究表明，癌症是由基因突变引起的，基因突变可由致癌剂引起，也可由DNA代谢过程中产生的碱基错配引起[1]。错配修复系统能修复DNA复制过程中出现的碱基错配。细胞错配修复系统功能丧失使复制时发生的碱基错配得不到纠正，从而使基因突变累积。错配修复基因异常在遗传性非息肉性结肠癌中的报道较多，但在膀胱肿瘤中的报道很少，本研究采用免疫组化方法研究错配修复基因hMSH2在膀胱移行细胞癌中的表达及意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 收集1996～2008年河南科技大学第一附属医院手术切除的20例正常膀胱组织和80例膀胱移行细胞癌组织。80例膀胱移行细胞癌组织中按WHO分级标准：G1级23例，G2级36例，G3级21例;按UICC分期：浅表性癌(Ta～T1)57例，浸润性癌(T2～T4)23例。

　　1.2 主要试剂 兔抗人hMSH2多克隆抗体(稀释度1∶100)，购自北京博奥森生物技术有限公司，SABC试[4] Vanmuylder N, Evrard L, Daelemans P. Expression of heat shock proteins in salivary gland tumors. Immunohistochemical study of HSP27, HSP70, HSP90, HSP110: apropos of 50 cases[J].Ann Pathal, 2000, 20(3):190-195.

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　　[6] 薛军,支学军,张振忠,等.胃癌、食道癌肿瘤耐药标志物Pgp、HSP表达的研究[J].中国肿瘤临床与康复,2002, 9:42-43.剂盒、DAB显色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.3 试验方法 标本经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋，4 μm切片,脱蜡。30%过氧化氢1份与10份蒸馏水混合，室温5 min以灭活内源性酶。蒸馏水冲洗3次。将切片浸入0.01 mol枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，高压修复110 s，自然冷却后PBS冲洗2次。滴加5%封闭液，室温20 min，甩去多余液体，滴加一抗，4℃过夜。滴加生物素化山羊抗兔血清20 min，PBS冲洗2次，每次2 min。滴加SABC20 min，PBS冲洗5次，每次4 min。取1 mL蒸馏水，加试剂盒中ABC试剂各1滴，混匀后加至切片，约10～15 min后胞核显色。苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜下观察。

　　1.4 结果的判断 参照Jin等的判断标准[2]：hMSH2表达位于细胞核,胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞。随机选择5个独立高倍视野(×40) 中阳性细胞数,不考虑着色强度，无阳性细胞为阴性;阳性细胞数≤20%为低表达;阳性细胞数>20 %为高表达。

　　1.5 统计学处理 卡方检验和直线相关，统计分析过程以SPSS16.0软件完成。

　　2 结果

　　hMSH2只表达于细胞核，在80例膀胱移行细胞癌中21例(26.25%)呈低表达，59例(73.75%)呈高表达，在20例正常膀胱组织中均为高表达，hMSH2在膀胱移行细胞癌中的低表达率(26.25%)高于在正常膀胱组织中的低表达率(0)，有统计学意义(P<0.05)，r=0.250;hMSH2在膀胱移行细胞癌G1、G2、G3 3组中分别有3(3/23，13.04%)、8(8/36，22.22%)、10(10/21，47.61%)呈低表达，3组间低表达率在总体差异上有统计学意义(P<0.05)，r=0.290;T2～T4组10例(10/23，43.48%)呈低表达，Ta～T1组11例(11/57，19.30%)呈低表达，T2～T4组低表达率高于Ta～T1组，有统计学意义(P<0.05)，r=0.241，见表1。表1 hMSH2蛋白的表达与临床病理特征的关系

　　3 讨论

　　膀胱移行细胞癌的发生是个多因子、多阶段、多因素、多步骤的复杂过程。大量研究表明，癌症是由基因突变引起的。为了确保遗传物质的完整和稳定，细胞有许多防止基因突变的系统，其中包括切除修复、直接修复、重组修复和错配修复(mismatch repair, MMR)。人类细胞中的DNA错配修复主要涉及6个修复蛋白，即hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hMLH3、hPMS1。与大肠杆菌MutS蛋白类似的二聚体有hMutSα和hMutSβ两种，复合物成分分别为hMSH2/hMSH6和hMSH2/hMSH3[3]，hMutSα主要识别单碱基错配和1或2个核甘酸的插入—缺失错配;hMutSβ主要修复2～16个核甘酸的插入—缺失修复[4]。人类错配修复系统主要功能是通过修复碱基—碱基，插入缺失环及DNA复制和重组期间产生的异源性错配维持遗传保真度增强DNA复制忠实性，维持基因组稳定及降低自发性突变，如果细胞错配修复功能缺陷不能及时修复DNA复制过程中产生的错误，将导致基因组DNA(包括癌基因、抑癌基因以及其他与肿瘤发生关系密切的基因)突变的积累，最终可导致肿瘤的发生。目前研究较为透彻的MMR 系统为大肠杆菌的甲基定向错配修复。修复基因异常不仅见于遗传性非息肉性结肠癌，还见于胃癌、肠道肿瘤、内膜癌、膀胱癌等。然而错配修复基因特别是hMSH2在膀胱移行细胞癌发生、发展过程中的作用报道的比较少。

　　我们采用免疫组化法研究hMSM2在膀胱移行细胞癌中的表达，其结果显示hMSH2在膀胱移行细胞癌中的低表达率(26.25%)明显高于在正常膀胱组织中的低表达率(0%)，表明hMSH2的表达缺失可能与膀胱移行细胞癌的发生有关。80例膀胱组织中错配修复基因hMSH2 有8例表达阴性，72例均有细胞核内表达的现象，提示错配修复基因hMSH2可能主要在细胞核内产生作用，从而影响膀胱移行细胞癌的发生、发展。Leach等[8]采用逆转录PCR(RT-PCR)法对21例膀胱癌患者膀胱冲洗液进行hMSH2 mRNA的检测,4例未检出hMSH2 mRNA患者证实为恶性程度较高的低分化肿瘤,相应免疫组化技术未测出其蛋白产物表达,提示hMSH2两条等位基因的突变可能导致其产物缺失,致错配修复功能丧失。有研究表明hMSH2表达下调或缺失的肿瘤通常伴有微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)的发生[9]。现推测错配修复基因缺陷可能导致膀胱肿瘤发生的机制：MMR基因本身发生突变或外源性被修饰而失去错配修复功能，在DNA复制过程中产生大量的复制错误并可能产生MSI，由于大量的复制错误的积累使某些癌基因、抑癌基因及某些生长因子活性改变,如转化生长因子TGF-βRⅡ等一些生长因子受体失活。

　　另有一些学者分别应用RT-PCR技术和免疫组化染色检测在胃癌组织和子宫内膜癌中错配修复基因的表达情况，其结果表明胃癌和子宫内膜癌的发生伴随着hMSH2基因的表达上调，其结论与本实验相反。机制可能为：①目前干细胞的研究观点认为,当细胞处于不同的分化状态时，同一基因的表达水平也出现差异[10]，因此推测：对于本实验与一些文章出现的截然相反的结论，其原因可能为我们所研究的细胞不处在相同的分化状态，导致了表达水平的差异性。所以在以后的研究中我们应尽可能使细胞处于相同的分化状态，这样易于结果之间的比较。②Gonda等[11]的研究表明hMSH2与PCNA表达呈正相关，提示二者在细胞增殖调控中可能存在正反馈调节机制，PCNA高表达的细胞增殖活动旺盛，容易出现基因的多点突变和DNA复制错误，使hMSH2基因表达代偿性上调，但增多的基因产物仍不足以修复已发生损伤的基因，使细胞向恶性转化。p53是目前功能最为明确的抑癌基因, 而错配修复基因在功能上类似于抑癌基因，有研究表明[12]p53和hMSH2蛋白在大肠癌组织中的表达呈正相关，那么p53和hMSH2蛋白在膀胱肿瘤中的表达是否也具有相关性，以及体内是否还存在其他与hMSH2蛋白表达关系密切的基因，还有待进一步研究。③肿瘤细胞的恶性增殖,增加了碱基错配的几率,hMSH2蛋白表达代偿性增高，而翻译出的蛋白很可能出现结构异常,这些结构异常的蛋白将失去其正常功能。

　　hMSH2蛋白的低表达与膀胱移行细胞癌分期、分级经统计学处理表现有相关性，具有相关关系，表明hMSH2的表达缺失不仅作用于肿瘤的发生阶段，而且作用于肿瘤的发展阶段，肿瘤的分期、分级越高其预后越差，因此提示hMSH2蛋白的低表达可以作为预测肿瘤预后的指标。李梅等[13]的研究表明hMSH2蛋白表达强度与胃癌分化程度无相关关系，其原因尚不清楚，有待研究。hMSH2蛋白低表达与膀胱肿瘤中细胞分化程度有关，说明肿瘤组织中细胞分化不同, hMSH2 mRNA呈现不同的表达，关于错配修复基因hMSH2的表达与膀胱肿瘤组织中细胞分化异常是否存在分化诱导及转录水平的调控异常机制，是值得进一步研究的课题。

　　膀胱癌占全部恶性肿瘤的3.2%，而膀胱移行细胞癌占全部膀胱肿瘤的90.3%[14]，而错配修复基因hMSH2在正常膀胱组织中均为高表达，说明错配修复基因在人体内很稳定，其自身存在着一种自我保护机制，但错配修复基因的这种保护机制目前尚不清楚，有待进一步研究。

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