端锚聚合酶在大鼠肝癌发生中的动态变化

　　【摘要】 目的 探讨端锚聚合酶(tankyrase)和端粒酶在肝细胞肝癌发生、发展过程中的动态变化。方法 二乙基亚硝胺诱导大鼠肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生，采用Western blot法检测端锚聚合酶的表达，TRAP方法检测端粒酶活性。结果 在肝细胞癌变过程中，相对于端粒酶在正常组织和癌前病变中的低水平表达，端锚聚合酶在肝炎期表达就显著增加。但至肝硬化，特别是肝癌期两种检测指标的表达均至高峰，并呈正相关关系(P=0.069，r=0.849)。结论 端锚聚合酶可调控端粒酶活性，二者与肝细胞肝癌的发生、发展密切相关

　　【关键词】 端锚聚合酶;端粒酶;肝癌

　　Alteration of Tankyrase in Development of Hepatocellular Carcinoma

　　CHEN Ying,DENG Miao,KONG Qingzhong

　　(School of Life Science and Technology，Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003,China)

　　Abstract:Objective To explore the alterations of tankyrase and telomerase activity in the development of hepatocellular carcinoma (HCC). Methods HCC induced by diethyl nitrosoamine (DENA); the expression of tankyrase was detected using western blot analysis, whereas telomerase activity was assayed using TRAP (telomeric repeat amplication protocol) method. Results Compared with the low telomerase activity, tankyrase was significantly increased in inflammation lesion. However, in hepatocirrhosis and HCC stages, two factors reached to peak point. The expression of tankyrase had close correlation with telomerase (P=0.069,r=0.849). Conclusion Telomerase is regulated by tankyrase. Tankyrase and telomerase are closely related to the progression of HCC.

　　Key words:tankyrase;telomerase;hepatoma

　　端锚聚合酶(tankyrase)是多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADPribose) polymerase (PARP)]家族成员之一，通过调控端粒酶与端粒的结合，间接参与端粒长度的调控[1]。在肿瘤发生过程中端锚聚合酶与端粒酶的相关性尚存争议。因此，我们探讨端锚聚合酶和端粒酶在肝癌发生不同时期的动态变化及相关性，以期为今后更深入地研究肿瘤发生机制及诊治积累资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 大鼠肝癌模型的建立 3个月龄平均体重为(120±5)g的雄性SpragueDawley(SD)大鼠(购于河南郑州大学实验动物中心)在平均温度(22±3)℃，湿度(40%～70%)，间隔12 h光照的条件下饲养。适应环境1周后，随机分为对照组和造模组各42只。根据SoltFarber方法，以2‰(w/w)的二乙基亚硝胺(diethyl nitrosoamine,DENA)(N-0756, Sigma, St. Louis, MO)制备肝癌模型，15周后停药。分别在给药的第3、6、9、12、15、18、21周随机处死对照组及造模组中的6只大鼠。取少量新鲜肝组织置于4%的多聚甲醛，4℃固定过夜后行石蜡包埋和HE染色。其余组织迅速放入液氮中冷冻，随后置-80℃保存。

　　1.2 端粒酶活性的检测 用Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒以TRAP(telomeric repeat amplification protocol)方法检测端粒酶活性，操作步骤按说明书，每组实验重复3次。端粒酶相对活性=(样本A450nmA690nm/阳性对照A450nmA690nm)×100%。

　　1.3 端锚聚合酶蛋白表达的检测 细胞总蛋白75 μg在6% SDSPAGE中恒压电泳后转移至硝酸纤维素膜上并用5%的脱脂奶粉封闭。分别加入端锚聚合酶(sc8337)(1∶500)和actin(sc1616)(1∶1 000)一抗4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗以化学发光法(sc2048)检测端锚聚合酶的表达。actin作为内对照，Labworks 4.0 软件(UVP，Inc. USA)定量分析二者的表达强度。每组实验重复3次。

　　1.4 统计学分析 SPSS11.0软件对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)和Spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 大鼠肝组织病理分型 根据大鼠肝癌的诊断标准由两位病理医生进行病理分型[2]。造模组的病变可大致分为3阶段：炎症期(12周之前)、肝硬化期(15周)和肝癌期(18～21 周)。

　　2.2 端粒酶活性的变化 对照组及造模组的炎症期和癌旁组织中端粒酶活性较低并维持在相对稳定的水平，端粒酶相对活性介于23.3%～41%之间。随着病变的演进，端粒酶活性在肝硬化期急增至62.8%(P=0.02)，并在其后的癌症发生过程中持续保持这一高水平(P<0.01)，而癌旁组织无显著性差异(图1)。

　　2.3 端锚聚合酶蛋白表达的变化 端锚聚合酶蛋白在整个诱癌过程中呈先上升后下降再上升的表达变化趋势(图2)。对照组中端锚聚合酶蛋白少量表达，炎症早期(诱癌3周)其表达量显著增加(P<0.001)，至后期(12周)又下降至正常水平(P=0.834)。但在肝硬化及肝癌阶段其表达量又激增，此时的表达量是正常组织的3.1～5.8倍(P<0.001)。而癌旁组织端锚聚合酶的表达无统计学意义(图3)。

　　2.4 端锚聚合酶与端粒酶之间的相关性 端锚聚合酶蛋白的表达与TERT(P=0.016，r=0.943)的表达变化呈正相关关系。

　　3 讨论

　　端粒长度在维持染色体末端结构的完整性、染色体复制及调控细胞衰老和癌症发生等诸多细胞生物学过程中都发挥着重要作用。端粒酶可通过维持端粒长度使细胞越过Hayflick极限，促使细胞永生化及癌变。正常体细胞中端粒酶活性受到严格的调控，而80%以上的肿瘤细胞中端粒酶活性却显著升高[3]。

　　本研究发现，端粒酶活性随肝癌的发生、发展逐步升高。正常肝组织、炎症期和癌旁组织中端粒酶活性较低，至肝硬化和肝癌期端粒酶活性急剧升高。端粒酶活性在炎症期受损细胞中表达升高，提示此时通过上调端粒酶的表达来维持器官的正常功能[4]。诱癌后期端粒酶活性的激增可能导致端粒功能的恢复和基因组稳定性的增加，促使细胞生存能力进一步增强，使细胞向永生化直至癌变方向发展。

　　在由端粒酶介导的端粒延伸的癌细胞中，端锚聚合酶等端粒相关蛋白可通过调控端粒酶与端粒的结合，而诱导端粒延伸[5，6]。研究发现端锚聚合酶在诱癌过程中出现两次表达高峰，与正常组织中端锚聚合酶的表达相比均有显著差异。而在由炎症期向肝硬化和肝癌期转换时端锚聚合酶表达量却降至正常表达水平，且癌旁组织中其表达无显著性差异。提示不同的端锚聚合酶亚型参与诱癌不同时期病变的发生与发展[7，8]。与多个小组的研究结果相一致，本研究还发现，端锚聚合酶不仅在癌细胞中表达升高，且与端粒酶活性呈正相关[9，10]。提示端锚聚合酶可能通过抑制TRF1与端粒的结合，促进端粒酶与端粒的结合，间接调控端粒酶全酶的完整性和活性。

　　肿瘤细胞中端粒的缩短可导致肿瘤细胞的衰老和死亡，目前已将端粒酶作为肿瘤治疗的靶点[11-13]。但研究发现端粒酶抑制剂不能完全抑制端粒酶活性，所残留的端粒酶活性和部分缩短的端粒又可引起靶细胞对端粒酶抑制剂的耐受性。抑制端锚聚合酶活性的升高不仅可以使端粒末端得到保护，还可阻断端粒酶与端粒的结合，进而诱导癌细胞的衰老，并增加端粒酶抑制剂的药理学效应[14，15]。因此更为详尽地阐明端锚聚合酶在肿瘤发生中的作用，特别是不同类型的端锚聚合酶在肿瘤发生中的作用，将对肿瘤发生机理的认识及肿瘤的诊治有着积极、重要意义。

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