融合毒素TOP3表达载体的构建

　　【摘要】 目的构建融合毒素TOP3的原核表达载体，为研究该融合毒素的功能及分析评价临床应用前景奠定基础。方法 构建原核表达载体pET-28a(+)-TAT-ODD-CASPASE3[pET-28a(+)-TOP3]，并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内诱导表达。结果 经酶切分析及DNA序列分析，所构建的质粒均插入TAT-ODD-CASPASE3融合基因。结论 成功构建原核表达载体pET-28a(+)-TOP3，并在IPTG诱导下获得特异性表达。

　　【关键词】 TOP3 原核表达载体 克隆

　　CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF A FUSION TOXIN TOP3IN PROKARYOTIC EXPRESSION SYSTEM

　　Liu Fang, Dang Guoquan

　　(Dept. of Biochemistry, Qinghai University Medical College)

　　Abstract Objective

　　To construct and express fusion toxin TOP3 in order to develop a targeted toxin that capable of eliminating abnormal cells, for example, cervical carcinoma cells. Methods The expression prokaryotic plasmids pET-28a (+)-TAT-ODD-CASPASE3 〔pET-28a(+)-TOP3〕 was constructed, and transformed pET-28a (+)-TOP3 into E. coli BL21(DE3)pLysS strain to be induced by IPTG. The obtained proteins were analyzed by SDS-PAGE. Results The recombinant plasmids were constructed successfully. E.coli transformed with the recombinant plasmid expressed an extra band. Conclusion The present study has successfully constructed prokaryotic expression victor of pET-28a (+)-TOP3 andgained specific expression induced by IPTG .

　　Key words TOP3 Prokaryotic expression vector Cloning

　　人类免疫缺陷病毒HIV-1编码的反式激活蛋白TAT(Trans-activator transcription)由86个氨基酸组成，包含5个功能区：N端区域(氨基酸1-21)、富含半胱氨酸区域(氨基酸22-37)、核心区域(氨基酸38-48)、基础区域(氨基酸48-57)及可变长度的C端区域。外源性TAT能通过细胞膜直接进入细胞，激活HIV-1的复制。Vivce等对TAT的细胞膜转导作用进行了研究，发现TAT分子中一个富含碱性氨基酸、具有较多正电荷的多肽片段与跨膜转导有关，因而被称为PTD区段(Protein transduction domain),即蛋白转导结构域[1,2]。TAT蛋白PTD的核心序列由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR，该转导序列能够有效引导肽段或者蛋白质进入细胞，具有蛋白传送功能，且转导速度快、效率高。

　　HIF-1(hypoxia inducible factor-1) 是公认的缺氧调节中的核心因子,其生物学活性由HIF-1α决定，在HIF-1α 401-603区域为氧依赖降解区(Oxygen dependent degradation domain,ODD)，常氧时借助402、564位脯氨酸羟化，通过激活泛素-蛋白酶体途径使HIF-1α迅速降解;而肿瘤细胞处于缺氧状态时，以上HIF-1α降解途径被阻断[3-5]，HIF-1α累积而更有效发挥其生物学活性来调节下游众多基因的表达。

　　借助于人类免疫缺陷病毒HIV-1 Tat-PTD区的转导功能、HIF-1αODD区的氧调节作用、天冬氨酸异性半胱氨酸蛋白酶3(Cysteinylaspartate specific protease 3, Caspase3)在细胞凋亡途径中的中枢作用，本研究构建了特异性表达于低氧细胞的融合毒素TOP3的原核表达载体。这对于探索具有诱导肿瘤细胞凋亡作用的目的蛋白，如何有效并且特异性地在低氧恶性实体瘤细胞中发挥生理功能具有重要的意义，同时也为应用该融合毒素治疗恶性实体瘤的研究奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　DH5α感受态细胞购自道普生物科技(北京)有限公司;pET-28a(+)、大肠杆菌BL21(DE3)菌株购自Novagen公司; 10%胎牛血清购自Hyclone公司;DMEM培养基、Trizol试剂购自Invitrogen公司; MmLV逆转录酶购自Promega公司;Taq DNA聚合酶购自Takara公司;EcoRⅠ、SalⅠ、NotⅠ、XhoⅠ核酸内切酶，T4连接酶购自Bio-Rad 公司。BGC823细胞由北京肿瘤医院分子生物学实验室馈赠。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养：BGC823细胞用含5%FBS的DMEM培养液培养，同时在培养液中加入青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)。细胞按常规条件(37℃，5% CO2 ，恒定湿度)培养，取生长密度为80%～90%时的细胞提取RNA。

　　1.2.2 TAT-PTD合成：根据NCBI GeneBank的基因序列设计合成正链序列为5′AATTC TAT GGC AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA AGA G3′，5′端、3′端斜体分别为EcoR I、Sal I内切酶粘性末端;合成负链序列为3′G ATA CCG TCC TTC TTC GCC TCT GTC GCT GCT TCT CAGCT5′，5′端、3′端斜体部分分别为Sal I、EcoR I内切酶粘性末端;中间正体部分为TAT蛋白转导结构域核心区序列。用双蒸去离子水溶解，70℃变性15 min，室温下自然降温1 h,自然复性为互补双链，4℃冰箱储存备用。

　　1.2.3 BGC823总RNA提取：收集BGC823细胞，按照 Trizol试剂的操作说明提取 RNA，紫外定量后置-70℃冰箱储存备用。

　　1.2.4 逆转录聚合酶链反应：以BGC823 cDNA为模板，分别扩增基因HIF-1α、Caspase3目的片段。逆转录反应：总BGC823 mRNA 5 μg、Oligo(dT) 5 μg、dNTP(10mmol/L)4 μl、MmLV 1 μL、RNasin 0.5 μL、5×Buffer 6 μL加DEPC水至总体积30 μL，经37℃ 1 h逆转录反应，再经70℃ 15 min变性，cDNA 置-20℃冰箱储存备用。PCR体系：BGC823 cDNA1 μL、上游引物和下游引物各1 μL、10×Buffer 3 μL、4 mM dNTP 1 μL、Taq DNA聚合酶1μL补H2O至30 μL。 PCR参数：94℃变性 5 min;94℃ 45 s、52℃ 45 s、72℃ 45 s (30个循环);72℃延伸5 min。引物设计参照NCBI GeneBank基因序列，运用Oligo6.0软件自行设计，并在引物5′、3′端设计酶切位点。引物序列：HIF-1α-ODD上游5′CTT gtc gac AAC CCA TTT TCT ACT CAG G3′，下游3′CTT GGA TGA CGA TTA CGG Tcg ccg gcg TG5′, 设计扩增长度 219 bp，斜体分别为Sal I、Not I酶切位点;Procaspase3上游5′GCT gcg gcc gcA TGG GTG CTA TTG TGA GGC3′，下游3′TTT ACC AAC CAA CCA CCA Aga gct cTCA5′，设计扩增长度920 bp，斜体分别为Not I、Xho I内切酶酶切位点。扩增的PCR产物经Gel ID凝胶图像分析系统拍片并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物,置-20℃冰箱备用。

　　1.2.5 原核表达载体的构建：合成的TAT-PTD与经EcoR I/Sal I双酶切的表达载体pET-28a(+)进行连接，构建重组质粒pET-28a(+)-TAT。ODD、Procaspase3 PCR产物经回收、纯化后，分别与pGEM-T载体相连,所获阳性重组子依次经Sal I/Not I、Not I/Xho I双酶切后与同样酶切的表达载体pET-28a(+)-TAT、pET-28a(+)-TAT-ODD进行连接反应，最终得到的阳性重组克隆pET-28a(+)-TAT–ODD-Proaspase3命名为pET-28a(+)-TOP3。取2 μL重组质粒pET-28a(+)-TOP3转化10 μL DH5α感受态细胞，用卡那霉素平板筛选，挑选阳性克隆，37℃摇菌过夜，提取质粒，经EcoR I和Xho I双酶切鉴定，酶切释放片段1155 bp，送测序鉴定无误后，再扩大培养。

　　2 结果

　　2.1 人HIF-1αODD区的PCR扩增

　　RT-PCR扩增目的产物大小与所设计的大小完全一致，大小为219 bp(见图1)。

　　M:DNA Marker;1: HIF-1α ODD

　　图1 人HIF-1α ODD区 PCR产物电泳图

　　2.2 Procaspase3的PCR扩增

　　RT-PCR扩增目的产物大小与所设计的大小完全一致，大小为920 bp(见图2)。

　　2.3 重组质粒的鉴定

　　将纯化的重组质粒pET-28a(+)-TOP3经EcoR I和Xho I双酶切鉴定，酶切释放片段为1155 bp，与设计的重组片段长度一致。测序报告显示,核苷酸的序列以及表达框无误,表明pET-28a(+)-TOP3原核表达重组质粒构建成功。

　　3 讨论

　　肿瘤是一个多因素、多环节、多阶段的复杂疾病，单一因素的介入往往不能达到理想的抑瘤效果。因此寻找新的治疗方案及将多种治疗方法联合应用是肿瘤治疗研究的热点。肿瘤生物治疗是指在肿瘤治疗中应用生物学物质或生物制剂。生物制剂如何有效并且特异地进入肿瘤组织发挥其特有的生物学功能是“限制”肿瘤生物治疗的一个重要方面。

　　根据恶性实体瘤缺氧这一特性，本研究构建了能特异性表达于低氧细胞的TOP3融合毒素(TAT-Procaspase3,TOP3)的原核表达载体。拟表达一种对缺氧瘤细胞有特异性杀伤作用的。TOP3由HIV-TAT区、HIF-ODD区及Procaspase3组成[4，5]。有研究表明，TOP3中HIV-TAT蛋白转导域可以将其转导入细胞，且转导效率较其他的转导域如ANTP、HSV-VP22更高。HIF-ODD区具有氧调节特性，可调节HIF-1 α的稳定性[6]，在常氧细胞内由于ODD 区的介导作用,TOP3降解;但在低氧肿瘤细胞内TOP3 可蓄积并诱导Procaspase3活化产生caspase3，进而发挥其可能的肿瘤细胞凋亡诱导功能。根据此机理，TOP3通过ODD的作用来维持其在细胞中的稳定性。进一步研究发现，使用ODD区的557～574序列并不影响其功能但可以降低融合毒素的分子量[4]。Procaspase3为细胞调亡的终末效应分子，也是各个调亡途径的关节点，该酶分子经活化产生caspase3，可在细胞内特异性诱导细胞凋亡，并有报道称，其活性在缺氧下可以被激活[7]。本研究借助TAT的穿膜特性、 HIF-ODD区的氧调节特性和caspase3的促凋亡特性成功构建了TOP3的原核表达载体。

　　TOP3作为一种靶向性药物具有以下优点：(1)在缺氧条件下可以使融合毒素稳定存在于细胞内，从而有效促使肿瘤细胞发生凋亡;(2)在常氧下ODD区可以诱导该融合毒素经泛素-蛋白降解系统降解，从而对正常组织所造成的损伤较小。所以TOP3是一种稳定的、特异的、高效的细胞内杀伤性药物。根据TOP3的特点与宫颈癌在缺氧下所表现的特性，设计使用将TOP3作为靶向性药物对缺氧性宫颈癌细胞进行特异性杀伤将成为我们下一步的研究工作内容。

　　【参考文献】

　　[1] Bayer P, Kraft M, Ejchart A, et al.Structural studies of HIV-1 Tat protein [J]. J Mol Biol,1995,247(4):529-535

　　[2] Morris MC,Depollier J,Mery J,et al.A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells[J]. Nat Biotechnol, 2001,19(12):1173-1176

　　[3] Tasciotti E, Zoppè M, Giacca M.Transcellular transfer of active HSV-1 thymidine kinase mediated by an 11-amino-acid peptide from HIV-1 Tat[J].Cancer Gene Ther,

　　2003,10(1):64-74

　　[4]Bruick RK, McKnight SL.A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF[J]. Science, 2001, 294(5545):1337-1340

　　[5]Huang LE, Gu J, Schau M, et al. Regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha is mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(14):7987-7992

　　[6]Schwart SM. Cell death and the caspase cascade [J]. Circulation, 1998， 97: 227- 229

　　[7]Chauhan A, Tikoo A, Kapur AK, et al. The taming of the cell penetrating domain of the HIV Tat: myths and realities[J]. Control Release， 2007，117(2):148-62