内毒素对Akt蛋白表达与磷酸化水平的影响

　　【摘要】 　　目的 探讨内毒素脂多糖(lipopolysaccharide LPS)在体内外对Akt蛋白表达和磷酸化水平的影响。方法 不同剂量LPS攻击RAW 264.7细胞，检测不同时相点细胞Akt蛋白表达和磷酸化水平。小鼠腹腔注射LPS 6 h后检测肺组织Akt蛋白表达和磷酸化水平。结果 不同剂量LPS攻击RAW 264.7细胞，细胞Akt蛋白表达没有显著差异，磷酸化水平增加。内毒素血症小鼠肺组织Akt蛋白表达无显著变化，磷酸化水平降低。结论 LPS在体内外对Akt蛋白磷酸化作用不同，体外Akt蛋白磷酸化水平增高，但内毒素血症小鼠体内出现Akt蛋白磷酸化水平异常降低。

　　【关键词】 脂多糖　Akt　磷酸化　内毒素血症

　　Effects of LPS on Akt Protein Expression and Its Phosphorylation

　　CHENG Xiao-gang1,YIN Hua-hua2,XIA Hao2,YAN Hong2,LIU Dao-cheng2,LI Lei2

　　(1.Department of Pathogeny,Chengdu Medical College,Chengdu 610083;2.Institute of Surgery Research,Laboratory of Surgery Research of State Key Labortory of Trauma, Burn and Combined Injury,Da ping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042)

　　Abstract：Objective To explore the effects of LPS on Akt expression and phosphorylation.Methods RAW264.7 cells were attacked with LPS.The Akt protein expression and phosphorylation level were detected by Western blot.The Akt protein phosphorylation level in the lung tissue of mice was detected by Western blot 6 hours after LPS attack.Results The Akt protein expression of RAW264.7 cells showed no obvious difference after attacks of different-dose of LPS,but their phosphorylation level were increased significantly.Whereas the Akt protein phosphorylation level decreased in the lung tissue of mice 6 hours after LPS attack.Conclusion The Akt protein phosphorylation level of Akt protein were different after LPS attack in vitro and in vivo.The Akt protein phosphorylation were increased obviously in vitro,but decreased in a murine model of endotoxemia.

　　Key words:LPS;Akt;phosphorylation;endotoxemia

　　LPS为G-菌细胞壁最外层结构，诱导单核/巨噬细胞表达多种前炎性介质，引起创伤后的免疫失调。LPS与血浆中的LPS结合蛋白(LBP)结合，再与靶细胞表面受体CD14等结合，激活CD14-TLR4-MD-2复合体，引起下游信号传递，导致TNF-α、组织因子 (Tissue factor，TF)等因子的表达。尽管LPS刺激引起单核/巨噬细胞TNF-α及组织因子TF表达的正性调控信号通路已有较多研究，然而，限制这些基因表达的信号通路仍不明了[1]。

　　反馈调控是机体维持自身平衡非常重要的生理机制，虽然目前对LPS刺激TLR4活化信号通路的负性调控有一些研究，然而对其调节的具体机制尚不十分明确[2]。新近研究显示，PTEN/PI-3K/Akt通路在炎症和内毒素血症的发生方面可能具重要调控作用[3]。但LPS对PTEN/PI3K/Akt通路关键分子Akt蛋白及磷酸化水平的影响尚不十分清楚。本研究拟在体外与体内分别检测LPS刺激后Akt蛋白及磷酸化水平的表达变化，以便对LPS信号通路的调控途径有更深入的了解。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　Balb/c小鼠12只，6～8周龄，雄性，质量20～21g。(购自重庆医科大学实验动物中心);兔抗Akt蛋白多克隆抗体及磷酸化Akt小鼠单克隆抗体购自Cell Signaling Technology(USA);β-actin小鼠单克隆抗体购自Sigma(USA);Goat anti-Mouse 二抗，Goat anti-Rabbit 二抗及CTL化学发光试剂盒购自Pierce(USA);LPS(0111：B4)购自Sigma(USA);蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂购自上海申能博彩公司;RAW 264.7细胞株购自中国科学院上海细胞所。

　　1.2 方法成都医学院学报

　　1.2.1 动物模型 正常对照组：每只小鼠腹腔注射 1 ml生理盐水;内毒素血症组：按文献[4]的方法：每只小鼠腹腔注射1ml LPS(400 μg /ml)溶液(LPS 20 mg/kg)，在LPS注射后6 h脱颈处死小鼠。切除肺组织并收集组织匀浆液上清，Bradford's法测定蛋白浓度后，以western blot测定肺组织Akt表达及pAkt水平。

　　1.2.2 RAW 264.7细胞的培养及LPS刺激 RAW264.7细胞在37℃、5%CO2的条件下，在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL)中贴壁生长。以不同浓度LPS 0、10、100、500 ng/ml，1、10 μg/ml刺激，于刺激后8、24、48 h收集细胞蛋白，Bradford's法测定蛋白浓度后以western blot测定Akt表达及pAkt水平(以与内参照β-actin的灰度比值表示)。

　　以无血清培养基过夜培养RAW 264.7细胞后，予LPS1μg/ml刺激，分别于刺激后5、10、20、30、45、60、120 min后收集细胞蛋白，Bradford's法测定蛋白浓度后以western blot测定Akt表达及pAkt水平(以与内参照β-actin的灰度比值表示)。

　　1.2.3 免疫印迹实验 用聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白(上样量为60μg总蛋白)，将蛋白电转到PVDF上，封闭后加一抗(1∶1 000稀释)、辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000稀释)，用化学发光试剂增强反应，X光片压片曝光，凝胶成像系统分析结果。洗膜后以β-actin抗体检测以校正结果。

　　1.3 统计学分析

　　以Quantity One软件进行定量分析，并以T检验及单因素方差分析进行统计分析。

　　2 结果

　　2.1 内毒素血症小鼠肺组织Akt蛋白表达及pAkt水平 实验结果表明，内毒素血症6 h后小鼠肺组织的Akt蛋白表达较正常小鼠略有增高，但无显著性差异(P>0.05)。而pAkt水平则较正常小鼠显著降低(P<0.01)(见图1)。

　　2.2 不同剂量LPS刺激RAW 264.7细胞后不同时相点Akt蛋白表达及pAkt水平 实验结果表明，不同剂量的LPS刺激RAW 264.7细胞8、24、48 h，Akt蛋白表达没有明显变化，而pAkt水平在8、24 h时表达均增高(P<0.05)。而在48 h时pAkt表达则在小剂量10、100、500 ng时增高(P<0.05)，大剂量1、10 μg时无明显变化(P>0.05)(见图2，表1、2)。

　　2.3 1 μg/ml LPS刺激RAW 264.7细胞后不同时相点Akt蛋白表达及pAkt水平图2 不同剂量LPS刺激RAW264.7细胞后不同时相点Akt蛋白表达及pAkt水平表1 不同剂量LPS刺激RAW 264.7细胞后不同时相点Akt蛋白表达(以与内参照β-actin灰度比值表示) 表2 不同剂量LPS刺激RAW 264.7细胞后不同时相点pAkt水平(以与内参照β-actin灰度比值表示) 表3 免疫印迹灰度分析1 μg /ml LPS刺激RAW 264.7细胞后不同时相点Akt表达与pAkt水平(以与内参照β-actin灰度比值表示) 结果表明，1μg/ml LPS刺激RAW 264.7细胞后2 h内各时相点Akt蛋白表达无明显差异，而pAkt水平在5 min、10 min、20 min时轻微降低，但没有显著性差异(P>0.05)，在30、45、60 min时显著增高(P<0.05)(见图3，表3)。

　　3 讨论

　　脓毒症是由感染引起的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，由其诱发的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)已成为当今外科ICU患者的首要死亡原因。然而，至目前为止，对激发脓毒症的细胞及分子机制及脓毒症病人在抵御炎症、维持自稳方面的生理机制尚不十分了解，对脓图3 1 μg/ml LPS刺激RAW 264.7细胞后不同时相点Akt蛋白表达及pAkt水平毒症病人并无确切有效的治疗措施。LPS是革兰氏阴性杆菌细胞壁的最外层结构，在启动体内免疫系统反应中发挥重要作用，是触发脓毒症的关键因素。阐明LPS的信号转导机制不仅可深入认识过度炎症反应的发生机制，更重要的是，可望为寻找其新的干预措施提供新思路。

　　反馈调控是机体维持自身平衡非常重要的生理机制，目前对LPS刺激TLR4活化信号通路的负性调控的研究，主要包括胞外的可溶性TLR4诱饵、胞内抑制物、膜结合的抑制物、TLR4的降解及TLR4诱导的凋亡。但对其相互关系及机制并不十分明了[5]。

　　PI3K是信号转导酶中的一个保守家族，参与调控细胞增殖及存活。最近研究提示，PI3K/Akt通路在炎症发生发展和内毒素血症的发生中可能发挥重要的调控作用[6]。PI3K持续表达于天然免疫细胞中，当细胞受病原微生物侵袭时，在TLRs成员的激发下，PI3K迅速活化，参与第一时相LPS信号通路的传导及调控。研究表明LPS攻击单核/巨噬细胞时可活化PI3K，活化的PI3K催化胞膜的磷脂肌醇的磷酸化，生成PI-3，4，5P3及PI3，4P2，从而引起PKB/Akt的膜移位及活化，在胞膜上募集的Akt可被磷脂酰肌醇依赖的激酶1活化，使其在Ser473及Thr308位双磷酸化而被活化。研究证实，PI3K/Akt通路活化后，可抑制LPS诱导的TNF在人单核细胞的表达，LPS诱导的人肺泡巨噬细胞的COX2 的表达，以及小鼠腹腔巨噬细胞NO的生成。而抑制PI3K/Akt通路可引起小鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮合酶(iNOS)基因表达增强，树突状细胞P38活性增强。用PI3K的抑制剂及表达显性负相(dominant-negative)的Akt则可引起LPS的MAPK通路活化以及AP-1依赖的转录。此外实验证实LPS诱导的抗炎细胞因子IL-10的产生依赖于PI3K/Akt的活化[1,7,8]。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是1997年发现的一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，其主要功能是使PI(3，4，5)P3的D3位点去磷酸化，从而降低细胞内PIP3的水平。而PI P3是PI3K/Akt通路的关键环节，PIP3的减少可降低PI 3K激活引起的Akt磷酸化，从而阻断PI3K/Akt信号通路。因此，PTEN是PI 3K/Akt信号通路中的一个重要的分子开关。当PTEN活性增强时，PI3K/Akt通路减弱，甚至关闭，而当PTTEN活性减弱时，PI3K/Akt通路则增强。最新研究显示， LPS刺激后，PTEN(+/+)小鼠的腹腔巨噬细胞MAPK激酶的活性增强，TNF-α等炎症介质的产生和释放明显高于PTEN(-/-)小鼠，提示PTEN在调控炎症反应中的地位非常重要，PTEN可能通过抑制PI3K/Akt这条负性调控通路起着促炎作用[9]。

　　因此，其下游分子Akt在LPS作用下如何变化，可能是PTEN/PI3K通路参与LPS信号转导调控的关键环节。本研究从LPS刺激后Akt蛋白及磷酸化水平的表达变化角度，分析Akt表达变化的原因及其意义，以便对LPS信号通路的调控途径有更深入的了解。研究结果表明LPS在体内外作用时Akt蛋白表达及磷酸化水平是不同的，最大的不同是LPS体外诱导Akt蛋白磷酸化水平呈剂量依赖性增高，而在体内则表现为Akt蛋白磷酸化水平的降低，究其原因可能是在体内影响信号传递的因素较体外复杂所致，体外实验中LPS持续存在，而体内由于代谢复杂，可能LPS发生降解，而且由于机体的保护性反应，炎性因素占主导地位，负性调控可能还未启动或是炎症反应过于激烈，负性调控启动后受抑，从而对机体调控LPS活化信号不利，可能参与内毒素血症引发的SIRS。另外，LPS刺激后30分钟即可引起磷酸化Akt的增高，提示Akt在LPS刺激后早期即参加了其信号通路的调节，而且在LPS持续存在下，表现出磷酸化水平的增高，可能对LPS信号的负性调控有一定作用。而在内毒素血症时Akt蛋白磷酸化水平降低，在这些体内外Akt磷酸化变化过程中PI3K及PTEN究竟扮演了何种角色，如何参与了Akt磷酸化水平的调控，从而在何种时期LPS信号通路发挥了相应作用，如何发挥作用则是下一步需要研究的主要问题。

　　【参考文献】

　　[1]Mausumee Guha,Nigel Mackman.The Phosphatidylinositol 3-Kinase-Akt Pathway Limits Lipopolysaccharide Activation of Signaling Pathways and Expression of Inflammatory Mediators in Human Monocytic Cells[J].The Journal of Biological Chemistry,2002，277(35)：32 124-32 132.

　　[2]Taro Fukao,Shigeo Koyasu.PI3K and Negative Regulation of TLR Signaling[J].Trends in Immunology,2003，24(7)：358-363.

　　[3]Schabbauer G,Tencati M,Pedersen B,et al.PI3K-Akt Pathway Suppresses Coagulation and Inflammation in Endotoxemic Mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004，24(10)：1 963-1 969.

　　[4]Cheng SS,Lukacs NW,Kunkel SL.Eotaxin/CCL11 Is a Negative Regulator of Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Endotoxemia[J].Experimental and Molecular Pathology,2002，73(1)：1-8.

　　[5]Foo Y Liew,Damo Xu,Elizabeth K,et al.Negative Regulation of Toll-like Receptor-Mediated Immune Responses[J].Nature,2005，5：446-458.

　　[6]Keqing Chen,Pablo Iribarren,Wanghua Gong，et al.The Essential Role of Phosphoinositide 3-kinases(PI3Ks) in Regulating Pro-Inflammatory Responses and the Progression of Cancer[J].Cellular & Molecular Immunology,2005，2(4)：241-252.

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　　[8]Ruma A,Pengal a,Latha P,et al.Lipopolysaccharide-induced Production of Interleukin-10 Is Promoted by the Serine/threonine Kinase Akt[J].Mol Immunol,2006,43(10)：1 557-1 564.

　　[9]Cao X,Wei G,Fang H,J et al.The Inositol 3-phosphatase PTEN Negatively Regulates Fc Gamma Receptor Signaling,but Supports Toll-like Receptor 4 Signaling in Murine Peritoneal Macrophage[J].Immunol,2004，172(8)：4 851-4 857.