Oct4基因的研究进展

　　【摘要】 Oct4基因是POU转录因子家族中的一员，主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞以及未分化胚胎癌中，对于维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新具有极其重要的作用。本文针对Oct4基因的分子结构、功能、调节通路以及与肿瘤的关系给予详细的阐述，以期为了解这一基因、开展相关研究提供便利。

　　【关键词】 Oct4基因;POU5F1基因;调控通路;肿瘤

　　Advances of Oct4 gene research

　　ZHENG Pengsheng, CAO Haozhe

　　(Department of Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Oct4 gene, a member of POU transcription factor family, is expressed in embryonic stem (ES) cells and embryonic carcinoma (EC) cells, but not in cells of differentiated tissues. It plays a critical role in maintaining pluripotent and selfrenewing state of embryonic stem cells. The molecular structure, function, regulation passageway and the relationship with tumors of Oct4 gene have been briefly reviewed.

　　KEY WORDS: Oct4; POU5F1; regulation passageway; tumor

　　Supported by the National Natural Science Foundation of China (General Program, No.30571951), the National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (No.30725043), and the 985 Project of Ministry of Education (cancer stem cells research)

　　哺乳动物在胚胎发育过程中受着多种基因的严密调控，以保证其有序地进行组织分化和个体发育。Oct4基因就是其中一个关键基因，也被称为Oct3、POU5F1、OTF3或OTF4，是POU转录因子家族中的一员。人的Oct4基因位于6号染色体上(6p21.31)，长度为16.40kb，具有多个转录起始位点，转录不同的mRNA亚型(Isoform)，从而翻译成多种蛋白质。Oct4 Isoform 1是转录的主要亚型之一，具有5个外显子，4个内含子(图1)，翻译的蛋白质含有一个保守的DNA结合结构域——POU结合域，它能与含八聚体基序(octamer motif)的DNA结合从而调控下游靶基因的转录。目前关于Oct4基因的研究主要针对Isoform 1，在鼠和人体内，它主要表达于胚胎干细胞及生殖干细胞中，对于维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新具有极其重要的作用。本文所提到的Oct4基因如未特别说明都属于此种亚型。

　　1 Oct4基因的亚型

　　通过对NCBI和Ensembl等生物信息网站检索，目前人Oct4基因共有11种Isoforms(图1)，翻译7种蛋白质(图2)。CAUFFMAN等[1]应用POU5F1A抗体和POU5F1B(Isoform 3)抗体研究发现，POU5F1A 表达于胚胎细胞和胚泡的细胞核中，POU5F1B表达于胚胎4细胞以前的所有细胞质中。LEE等[2]研究证实，Isoform 3不能激活Oct4依赖的启动子转录下游基因，并且它的过表达不能抑制POU5F1A的表达。这些研究提示Oct4基因的干细胞特性应归因于POU5F1A。实际上，POU5F1A抗体并不能区分Isoform 1、2、5。目前关于Oct4 Isoforms的研究较少，与其他基因的亚型研究一样，受到了检测方法的制约，尤其表现在mRNA不同而蛋白质相同的Isoforms研究中。这需要检测手段和技术的改进与创新。

　　2 Oct4蛋白的结构

　　POU结合域有两个亚单位：N端大约74～82个氨基酸残基构成POU家族特有的保守结构域(POUs)，Oct4基因有3个代表性的转录本，分别为Isoform1、3、7。Isoform1是最普遍的转录本，一般关于Oct4的研究都针对此种亚型。Isoform3为文献中提到的Oct4B。Isoform4是在乳腺癌细胞中发现的，翻译的蛋白质具有一个信号肽，为分泌蛋白或者为细胞外释放的蛋白。Isoform5发现于胚胎干细胞和WA01细胞系38代中。Isoform6发现于正常羊膜中。Isoform7是在胃、脑、胚胎干细胞、H9细胞系和其他9种组织中发现的。Isoform8发现于正常乳腺上皮细胞中。Isoform11发现于肺上皮细胞，它的5′端也许是不完整的。Isoform 2/9/10发现于一些cDNA克隆中。图绿色区代表了CDS序列，白色区代表UTR序列。

　　N端和C端各有一个脯氨酸富集区，中间为POU结合域。POUs含有75个氨基酸(138～212aa)，POUH含有60个氨基酸(230～289aa)。目前文献所知，Isoform1/2/610/11定位于细胞核;Isoform3/5定位于胞质;Isoform4可能为分泌型蛋白，N端含有信号肽结构(红色区域)。相同颜色代表了相同的氨基酸序列。

　　C端大约60个氨基酸残基构成传统的同源异型结构域(POUH)，中间由15～55个非保守的氨基酸序列相连。根据POU结合域的同源性和连接肽的长度，POU转录因子家族分为7个亚族，Oct4属于第V亚族。人Oct4 Isoform 1翻译的蛋白质POU结合域POUs含有75个氨基酸残基(138～212)，POUH含有60个氨基酸残基(230～289)，能特异地识别八聚体基序ATGCAAAT。此外，N端和C端各有一个脯氨酸富集区，这些脯氨酸富集区是Oct4因子的转录活性区。N端序列能够包绕DNA转录激活区，具有活化作用。C端除富含脯氨酸残基外，还有苏氨酸和丝氨酸残基，它的活性是细胞特异性的，而且此区也是磷酸化调节位点[3]。

　　3 Oct4基因的假基因

　　假基因(pseudogenes)的来源一般认为是在生物进化早期由mRNA反转录成cDNA，然后整合在基因组中。假基因一般没有内含子序列和启动基因转录的启动子序列，而在5'端有mRNA分子特有的多聚腺苷[poly(A)]序列。Oct4基因的假基因共有6种(图3)，与其mRNA序列有很高的同源性[35]。通过检索分析，我们发现Oct4假基因均来源于Isoform 1，Isoform 1可能是Oct4基因最原始的形式，其他Isoforms可能是在生物进化中逐渐产生的。目前认为假基因是不转录的基因，没有生物学功能，而SUO等[3]研究认为8和10号染色体上的Oct4假基因在肿瘤组织中是转录的，可能与肿瘤发生有一定的关系。Oct4假基因的转录虽未得到公认，但它的存在，给研究工作带来了一定的困扰和误解。

　　4 Oct4基因的功能

　　Oct4是迄今人们发现最早也是最重要的维持胚胎干细胞多潜能性和自我更新的关键基因。这种功能遗传于早期脊椎动物Oct4基因的同系物，并在不同种系之间高度保守[6]。通过细胞融合的方法，发现Oct4基因的表达与否在于胚胎干细胞的细胞核，并不依赖DNA的复制和细胞分裂，敲除Oct4基因时，小鼠胚胎是不能形成内细胞群即全能干细胞[7]。体外研究发现，Oct4随着组织细胞的分化其表达降低或消失。此外，通过沉默Oct4基因，鼠和人胚胎干细胞会向滋养层细胞分化，这种维持胚胎干细胞多潜能性的功能是剂量依赖性的[810]。研究发现，Oct4基因表达量的升高或降低，都会引起胚胎干细胞的分化，而且这种调节是极其精细的，小于2倍基础量可以使胚胎干细胞分化成滋养外胚层细胞，大于2倍的基础量可以使胚胎干细胞分化成中胚层细胞。

　　顶端的红线代表了Oct4基因Isoform1的cDNA序列，黑箭头之间的区间代表了编码区，假基因与Oct4基因的同源程度用不同的颜色和长度代表，并且具有方向性。

　　Oct4也具有维持成体干细胞多潜能性的功能。TAI等[11]发现Oct4基因在人皮肤基底细胞层个别细胞、乳腺干细胞和胃干细胞中表达。应用人胚胎干细胞培养条件，在人毛囊组织中发现Oct4阳性的上皮干细胞和黑色素干细胞都能自我修复和分化成多种细胞[12]。在鼠的体内试验中发现下调Oct4能使鼠神经干细胞分化[13]，异位表达Oct4基因可以阻止鼠上皮祖细胞的分化，并且引起上皮细胞的异常增生[14]。然而与此相反，LENGNER等[15]

　　研究认为缺失Oct4的鼠成体干细胞依然能够维持其自我更新。因此，Oct4基因在维持成体干细胞多潜能性和自我更新方面还有待于进一步的证实。

　　最近，两个实验都通过转染Oct3/4、Sox2、Klf4和cMyc基因从人体细胞中得到了多潜能干细胞或者胚胎样干细胞[1617]，PARK等[18]通过转染Oct4、Sox2、Nanog和Lin28基因也从人体细胞中得到了多潜能干细胞，而KIM[19]研究发现这些转染因子只有Oct4是形成多潜能性干细胞唯一不可缺的基因。

　　5 Oct4基因的调节通路

　　Oct4基因调节通路的研究目前主要集中在胚胎干细胞上。BOYER等 [20]鉴定出人类胚胎干细胞中有623个(3%)蛋白质编码基因和5个(3%)miRNA编码基因的启动子与Oct4关联。这些基因包括许多以往在小鼠胚胎干细胞研究工作中所确定或假定的Oct4靶基因，如Sox2、Nanog、LEFTY2/EBAF、CDX2、HAND1、DPPA4、GJA1/CONNEXIN43、FOXO1A、CRIPTO/TDGF1 和ZIC3等。这些基因大约一半是Oct4、Sox2和Nanog共同的靶基因，包括参与维持胚胎细胞多潜能性和自我更新的重要调节通路Tgfβ(如TDGF1、LEFTY2/EBAF)和Wnt(如DKK1、FRAT2)的基因。多项研究也表明了Oct4基因对形成和维持胚胎干细胞的多能性和自我更新是和Sox2和Nanog共同完成的[10，2123]。在人胚胎干细胞中，Oct4、Sox2和Nanog 也可能通过调节STAT3的表达来调控JAKSTAT3信号转导通路，从而对细胞的增殖分化产生作用。此外，它们会通过占据调节细胞分化的PRC2基因的靶基因而控制细胞的分化[24]。越来越多的研究表明，Oct4、Sox2和Nanog对大量靶基因及其自身编码基因的转录调控，主要是通过其前馈系统、自身调节网络和与其他信号转导通路协同作用来实现的[25]。

　　RODDA等[2627]研究认为Sox2Oct4属于多能性基因调节的顶级层次，它们联合控制Nanog并通过下游基因Esrrb、Rif1等调节细胞的多能性。TAKAHASHI和YAMANAKA[28]

　　研究发现，多潜能性干细胞可以通过加入4种因子Oct3/4、Sox2、cMyc和Klf4从鼠成纤维细胞中得到，而Nanog并不是必要的。Oct4缺失的胚胎干细胞即使有Nanog 表达，也不能起到维持胚胎干细胞不分化的作用[29]。MASUI等[30]研究认为Sox2通过直接或者间接方式调节Oct4的表达，进而影响胚胎干细胞的多潜能性，Sox2敲除的鼠胚胎干细胞只要维持Oct4的表达就可以阻止其分化。因此，Oct4在维持胚胎干细胞方面可能更据主导地位，这与诱导多潜能性干细胞的实验结论一致。

　　Oct4可以通过抑制Gata6阻止胚胎干细胞向原始内胚层分化，通过抑制谱系特异的转录因子FoxD3来抑制FoxA1和FoxA2的活化，从而阻止胚胎干细胞向内胚层前肠器官如肝和肺的发育[31]，通过抑制同源结构域转录因子Cdx2的表达和活化抑制胚胎干细胞向滋养外胚层分化;但同时Cdx2 也可以反作用于Oct4基因。这两种蛋白相互结合从而抑制了各自的作用，决定胚胎干细胞是否分化在于它们双方的争斗结果[32]。

　　Oct4基因的活化，也受到多种细胞因子的调节，Sall4结合在Pou5F1的高度保守调节区域以增强和激活Oct4基因的表达[33];氧水平可能是干细胞微环境的重要组成部分，它调节干细胞的自我更新和多能性，而缺氧因子HIF2正是通过结合Oct4启动子来实现其功能的[34];Tr2孤儿受体SUMO化修饰后可以精细调节干细胞中Oct4基因的表达，将其维持在一定的水平，促进干细胞的增殖[35]。在胚胎干细胞中，Oct4可以激活另外一个多潜能性转录因子Zfp206[36]，但Zfp206也可以激活Oct4和Nanog基因的转录[37]。Zfp143是另外一个可以协同Oct4激活Nanog表达的多潜能性调节基因[38]。除活化基因以外，最近发现PIAS家族PIASy、PIAS1和PIAS3蛋白可以阻止Oct4介导的转录因子激活[39]。然而这些研究结果在编织Oct4基因调控网络时还不够全面，需要联合更多的上游和下游基因或其他基因的研究来更清楚地了解Oct4基因的调节通路(图4)。

　　Oct4基因是维持胚胎干细胞多潜能性和自我更新的最关键基因。Oct4基因受Sox2基因直接或者间接的调节，它与Sox2、Nanog等调控胚胎干细胞自我更新的关键基因协同或者单独调控自身以及其他影响胚胎生长发育的转录因子，从而影响胚胎干细胞的命运。

　　6 Oct4基因与肿瘤

　　作为胚胎干细胞的特异性基因，Oct4主要表达于胚胎和生殖细胞肿瘤中，如睾丸生殖细胞瘤、精原细胞瘤、胚胎性癌和胚胎癌细胞系中。部分研究者在非生殖系统肿瘤细胞和组织，如胰腺癌Capan2、Pan1细胞系、肝癌Mahlava细胞系、宫颈癌HeLa细胞株、人乳腺癌MCF7细胞系以及乳腺癌组织和膀胱癌组织中也检测到了Oct4的表达[12，4043]。非生殖系统肿瘤细胞中表达Oct4的现象可以解释为细胞癌变过程中胚胎基因的激活，或者说是干细胞致癌的一种证据。然而，LEENDERT等[44]利用100多种肿瘤组织芯片的3439个标本进行Oct4基因表达情况筛查时却发现该基因在非生殖细胞肿瘤中几乎不表达，偶见于肺鳞癌和大细胞癌以及肾透明细胞癌中。这就出现了Oct4基因在肿瘤细胞系中的大量表达现象和目前研究结果在组织水平上(除膀胱癌外)基本不表达的结论之间的矛盾。有趣的是对于这种现象的解释，研究者很自然地倾向于肿瘤干细胞，因为肿瘤干细胞在肿瘤组织中所占比例极少[4547]，免疫组织化学染色检测不出也在常理之中，而细胞系很可能含有丰富的肿瘤干细胞，但是到目前为止，还没有研究确实证明Oct4基因在肿瘤干细胞中表达。

　　最近，部分研究者开始质疑Oct4蛋白在非胚胎性肿瘤细胞系和组织中的表达可能是假基因和亚型的影响，甚至是实验过程中对照设置的不合理而过度曝光造成的[4850]。Oct4基因是否在成体细胞肿瘤中表达正处于激烈的论战之中，但是，我们相信Oct4基因在肿瘤和肿瘤干细胞的研究中具有极其重要的意义。

　　近年来，Oct4基因随着干细胞研究的热潮愈来愈被重视。作为维持干细胞多潜能性和自我更新的关键基因之一，它的功能和调控机制将会随着研究工作的逐步深入越来越清晰。我们相信深入研究Oct4基因对于解开胚胎发育基因转录调控机制的神秘面纱具有重要的作用，同时也能为组织工程及肿瘤治疗提供必要的理论依据和实践基础。

　　【参考文献】

　　[1]CAUFFMAN G, LIEBAERS I, VAN STEIRTEGHEM A, et al. POU5F1 isoforms show different expression patterns in human embryonic stem cells and preimplantation embryos [J]. Stem Cells, 2006, 24(12):26852691.

　　[2]LEE J, KIM HK, RHO JY, et al. The human OCT4 isoforms differ in their ability to confer selfrenewal [J]. J Biol Chem, 2006, 281(44):3355433565.

　　[3]SUO G, HAN J, WANG X, et al. Oct4 pseudogenes are transcribed in cancers [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 337(4):10471051.

　　[4]PAIN D, CHIRN GW, STRASSEL C, et al. Multiple retropseudogenes from pluripotent cellspecific gene expression indicates a potential signature for novel gene identification [J]. J Biol Chem, 2005, 280(8):62656268.

　　[5]DERRICO I, GADALETA G, SACCONE C. Pseudogenes in metazoa: origin and features [J]. Brief Funct Genomic Proteomic, 2004, 3(2):157167.

　　[6]MORRISON GM, BRICKMAN JM. Conserved roles for Oct4 homologues in maintaining multipotency during early vertebrate [J]. Development, 2006, 133(10):20112022.

　　[7]DO JT, SCHLER HR. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells [J]. Stem Cells, 2004, 22(6):941949.

　　[8]GIDEKEL S, PIZOV G, BERGMAN Y, et al. Oct3/4 is a dosedependent oncogenic fate determinant [J]. Cancer Cell, 2003, 4(5):329330.

　　[9]HOUGH SR, CLEMENTS I, WELCH PJ, et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells after RNA interferencemediated silencing of OCT4 and Nanog [J]. Stem Cells, 2006, 24(6):14671475.

　　[10]MATIN MM, WALSH JR, GOKHALE PJ, et al. Specific knockdown of Oct4 and beta2microglobulin expression by RNA interference in human embryonic stem cells and embryonic carcinoma cells [J]. Stem Cells, 2004, 22(5):659668.

　　[11]TAI MH, CHANG CC, KIUPEL M, et al. Oct4 expression in adult human stem cells:evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis [J]. Carcinogenesis, 2005, 26(2):495502.

　　[12]YU H, FANG D, KUMAR SM, et al. Isolation of anovel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles [J]. Am J Pathol, 2006, 168(6):18791888.

　　[13]OKUDA T, TAGAWA K, QI ML, et al. Oct3/4 repression accelerates differentiation of neural progenitor cells in vitro and in vivo [J]. Brain Res Mol Brain Res, 2004, 132(1):1830.

　　[14]HOCHEDLINGER K, YAMADA Y, BEARD C, et al. Ectopic expression of Oct4 blocks progenitorcell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues [J]. Cell, 2005, 121(3):465477.

　　[15]LENGNER CJ, CAMARGO FD, HOCHEDLINGER K, et al. Oct4 expression is not required for mouse somatic stem cell selfrenewal [J]. Cell Stem Cell, 2007, 1(4):403415.

　　[16]TAKAHASHI K, TANABE K, OHNUKI M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors [J]. Cell, 2007, 131(30):861872.

　　[17]PARK IH, ZHAO R, WEST JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors [J]. Nature, 2007, 451(7175):141146.

　　[18]YU J, VODYANIK MA, SMUGAOTTO K, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells [J]. Science, 2007, 1917(318):19171920.

　　[19]KIM JB, ZAEHRES H, WU G, et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors [J]. Nature, 2008, 454(7204):646650.

　　[20]BOYER LA, LEE TI, COLE MF, et.al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells [J]. Cell, 2005, 122(6):947956.

　　[21]AVILION AA, NICOLIS SK, PEVNY LH, et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function [J]. Genes Dev, 2003, 17(1):126140.

　　[22]CHAMBERS I, COLBY D, ROBERTSON M, et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells [J]. Cell, 2003, 113(5):643655.

　　[23]MITSUI K, TOKUZAWA Y, ITOH H, et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells [J]. Cell, 2003, 113(5):631642.

　　[24]LEE TI, JENNER RG, BOYER LA, et al. Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells [J]. Cell, 2006, 125(21):301313.

　　[25]BOVER LA, LEE TI, CILE MF, et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells [J]. Cell, 2005, 122(6):947956.

　　[26]RODDA DJ, CHEW JL, LIM LH, et al. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2 [J]. J Biol Chem, 2005, 280(26):2473124737.

　　[27]LOH YH, WU Q, CHEW JL, et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells [J]. Nat Genet, 2006, 38(4):432440.

　　[28]TAKAHASHI K, YAMANAKA S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors [J]. Cell, 2006, 126(4):663676.

　　[29]MITSUI K, TOKUZAWA Y, ITOH H , et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells [J]. Cell, 2003, 113(5):631642.

　　[30]MASUI S, NAKATAKE Y, TOYOOKA Y, et al. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells [J]. Nat Cell Biol, 2007, 9(6):625635.

　　[31]HROMAS R, COSTA R. The hepatocyte nuclear factor3/forkhead transcription regulatory family in development, inflammation, and neoplasia [J]. Crit Rev Oncol Hematol, 1995, 20(12):129140.

　　[32]NIWA H, TOYOOKA Y, DAISUKE S, et al. Interaction between Oct3/4 and Cdx2 determines trophectoderm differentiation [J]. Cell, 2005, 123(55):917929.

　　[33]ZHANG J, TAM WL, TONG GQ, et al. Sall4 modulates embryonic stem cell pluripotency and early embryonic development by the transcriptional regulation of Pou5f1 [J]. Nat Cell Biol, 2006, 8(10):11141123.

　　[34]KEITH B, SIMON MC. Hypoxiainducible factors, stem cells, and cancer [J]. Cell, 2007, 129(4):465472.

　　[35]PARK SW, HU X, GUPTA P, et al. SUMOylation of Tr2 orphan receptor involves Pml and finetunes Oct4 expression in stem cells [J]. Nat Struct Mol Biol, 2007, 14(1):6875.

　　[36]WANG ZX, TEH CH, KUEH JL, et al. Oct4 and Sox2 directly regulate expression of another pluripotency transcription factor, Zfp206, in embryonic stem cells [J]. J Biol Chem, 2007, 282(17):1282212830.

　　[37]WANG ZX, KUEH JL, TEH CH, et al. Zfp206 is a transcription factor that controls pluripotency of embryonic stem cells [J]. Stem Cells, 2007, 25(9):21732182.

　　[38]CHEN X, FANG F, LIOU YC, et al. Zfp143 regulates Nanog through modulation of Oct4 binding [J]. Stem cell, 2008, 26(11):27592767.

　　[39]TOLKUNOVA E, MALASHICHEVA A, PARFENOV VN, et al. PIAS proteins as repressors of Oct4 function [J]. J Mol Biol, 2007, 374(5):12001212.

　　[40]ABATESHEN C. Homeobox genes and cancer:New OCTaves for an old tune [J]. Cancer Cell, 2003, 4(5):329330.

　　[41]WANG P, BRANCH DR, BALI M, et al. The POU homeodomain protein OCT3 as a potential transcriptional activator for fibroblast growth factor4 (FGF4) in human breast cancer cells [J]. Biochem J, 2003, 375(pt1):199205.

　　[42]ATLASI Y, MOWLA SJ, ZIAEE SA, et al. OCT4, an embryonic stem cell marker, is highly expressed in bladder cancer [J]. Int J Cancer, 2007, 120(7):15981602.