MDA-7/IL-24——肿瘤基因治疗的新武器

　　【摘要】 通过消减杂交法从人黑色素瘤细胞中分离出来的黑色素瘤分化相关基因(melonoma differentiation associated gene 7, MDA-7)，因其分子生物学特性与IL-10相似，故将其归入IL-10家族，并重新命名为IL-24。位于人染色体1q32的MDA-7/IL-24基因在原始黑色素瘤细胞及人免疫相关组织中表达。MDA-7/IL-24的膜受体IL-20R1、IL-20R2和IL-22R1在不同组织、细胞中的分布存在差异。MDA-7/IL-24具有广泛的抗肿瘤生物学作用。它能够通过膜受体或非受体介导的凋亡途径对多种肿瘤细胞产生杀伤作用，而不影响正常细胞。此外，MDA-7/IL-24还具有抑制肿瘤新生血管形成、增强放疗敏感性和免疫调节作用。作为一种具有多种抗肿瘤功能的细胞因子，MDA-7/IL-24在临床Ⅰ期试验中已显示出良好的治疗效果，将成为肿瘤基因治疗的新武器。

　　【关键词】 MDA-7/IL-24;肿瘤;凋亡

　　ABSTRACT: MDA-7/IL-24 is isolated from the IFN-β and mezerein treatedhuman melanoma cell line by differentiation induction subtraction hybridization. MDA-7/IL-24 is classified as a member of the IL-10 gene family because of the similarities in molecular biological characteristics. MDA-7/IL-24 gene is located at the 1q32 and expresseds in primary melanomas and normal humans immune-related tissues. The membrane receptors of MDA-7/IL-24, IL-20R1/IL-20R2 and IL-22R1/IL-20R2 are distributed disparitively in different cells and tissues. MDA-7/IL-24 has been found to display ubiquitous anti-tumor biological properties: inducing tumor cell apoptosis, inhibiting angiogenesis and enhancing the sensitivity of radiotherapy,but having no damage to the normal cells. As a multifunctional anti-tumor cytokine, MDA-7/IL-24 has been confirmed of the anti-tumor effect in the phaseⅠclinical trial, and it becomes a potential new weapon for tumor gene therapy.

　　KEY WORDS: MDA-7/IL-24;tumor;apoptosis

　　通过消减杂交(differentiation induction subtraction hybridization, DISH)方法，JIANG等和FISHER等[1-2]从干扰素β(interferon, IFN-β)和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)激活剂瑞香素(mezerein)诱导的人黑色素瘤细胞中发现了黑色素瘤分化相关基因(melanoma differentiation associated gene 7, MDA-7)。由于这一基因在染色体定位、空间结构及功能特性等方面与IL-10类似，故将其归入IL-10家族，并重新命名为IL-24[3]。随着MDA-7/IL-24研究的深入，其多种抗肿瘤生物学特性被揭示，包括促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤新生血管形成及增强肿瘤对放疗的敏感性。这些抗肿瘤生物学特性奠定了MDA-7/IL-24作为临床肿瘤基因治疗工具的基础。MDA-7/IL-24的抗肿瘤作用在临床Ⅰ期试验中已被证实，为未来MDA-7/IL-24的肿瘤基因治疗提供了有力支持。

　　1MDA-7/IL-24基因及编码蛋白

　　人MDA-7/IL-24基因位于染色体1q32。这一区域同时还包括了IL-10家族的其他成员，如IL-10、IL-19、IL-20。MDA-7基因长约2kb，由7个外显子和6个内含子构成。5′端上游-30～-25处有TATA盒，与启动有关;3′UTR区域含有多聚腺嘌呤信号和AU富集元件，后者与转录后mRNA稳定性有关[4]。MDA-7/IL-24编码分子质量为23.8ku，含有206个氨基酸残基的分泌型蛋白，其N-端49个氨基酸残基构成分泌型信号肽(signal peptide)，引导翻译后的IL-24蛋白穿过细胞膜分泌至细胞外。预测成熟分泌后的IL-24应为18.3ku。然而，实际在培养物上清中测得的IL-24蛋白分子质量约为21～35ku。这可能与MDA-7/IL-24分泌后的糖基化修饰有关[5]。蛋白结构分析显示第85、99、126位氨基酸残基为可能存在的糖基化位点。糖基化修饰是蛋白质翻译后的一种加工过程，对蛋白的正确折叠和成熟有重要作用，但其在促肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤的旁杀伤作用中并不是必需的[6]。最近，GUPTA等[7]利用融合蛋白GST-M4和EGFR抑制剂Tarceva联合治疗肺癌也取得了较好的疗效，而M4是含有MDA-7第104～206位氨基酸残基的一段截位倒转序列，与GST-MDA-7融合蛋白相比，其亦具有特异性的促肿瘤细胞凋亡作用。由此可见，MDA-7/IL-24基因开发应用的前景广阔。

　　2MDA-7/IL-24的表达

　　生理水平下，MDA-7/IL-24主要在正常人胸腺、脾脏、外周血单个核细胞等免疫组织和早期黑色素瘤细胞中表达[8]。用细菌脂多糖或植物血凝素体外诱导外周血单个核细胞可使单核细胞和T淋巴细胞表达IL-24，其mRNA于诱导12h达高峰，蛋白于24h达高峰，随后逐渐降低，72h仅有低水平蛋白存在[9]。此外，HUANG等[4]研究还发现，IFN-β和MEZ联合诱导多种肿瘤细胞株(DU-14、HBL-100、MDA-MB-157、MDA-MB-231、Hela、NC、GBM18和HONE-1)24h后，出现MDA-7/IL-24的短暂表达，且与细胞本身Rb、p53基因状态无关。但是，在HuPEC、MCF、T98G、SW613肿瘤细胞中未见表达。提示某些正常细胞及肿瘤细胞在一定条件下可被诱导表达MDA-7/IL-24。利用质粒或腺病毒载体使MDA-7/IL-24 基因异位过表达于肿瘤细胞，能特异性抑制多种肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞没有影响。

　　3MDA-7/IL-24的受体

　　MDA-7/IL-24基因属IL-10家族，基因序列与IL-10保持着23%的同源性，与IL-20同源性最高达33%，推测其蛋白空间结构与IL-10类似，由4个螺旋区通过环状结构连接构成[4,10]，而F螺旋区域是IL-10家族分子识别受体的重要结构域，故推测IL-24的受体可能与IL-10家族的受体分子相同。已知的IL-10家族受体亚单位有3个Ⅰ类受体(IL-10R1、IL-20R1和IL-22R1)和两个Ⅱ类受体(IL-10R2和IL-20R2)。WANG等[11]用IL-24-碱性磷酸酶(AP)结合转染有不同受体链的COS细胞并进行受体亲和力检测发现：IL-24-AP可结合转染有IL-20R2的COS细胞，但对同时转染有IL-20R1/IL-20R2受体或者IL-22R1/IL-20R2受体的COS细胞显示出更高的亲和力。AP染色证实，同时转染有IL-20R1/IL-20R2受体或IL-22R1/IL-20R2受体的COS细胞表面结合的IL-24-AP较多。由此提出IL-24的受体可能为两对异二聚体，即IL-20R1/IL-20R2和IL-22R1/IL-20R2。其中IL-20R1和IL-22R1的胞质部分较长，而IL-20R2胞质部分较短。IL-20R1和IL-22R1分布广泛[10,12-13]：Northern blotting显示正常肾、肝、小肠和胰腺中IL-22R1 mRNA高表达，肺、肾上腺、子宫中呈低表达;而IL-20R1 mRNA在正常皮肤、睾丸、心、胎盘、前列腺组织中呈高表达，在卵巢、胃、胰腺、脑组织中呈中等表达，而在肌肉、小肠、肝、肾中几乎检测不到。IL-20R2分布较局限[10,13]，在皮肤、睾丸中高表达，卵巢组织中中度表达，在肺、心、肌肉、胎盘等组织中低表达，而小肠中几乎检测不到。总而言之，IL-20R1/IL-20R2在皮肤和睾丸中表达最高，在人角质形成细胞HaCaT、免疫细胞中均可检测到，推测IL-24可能参与皮肤病变的发生和发展。大鼠损伤处皮肤边缘和基底部可以检测到IL-24相关分子c49a，更有力地证实了这一点[14-15]。尽管MDA-7/IL-24受体分布具有局限性，但MDA-7/IL-24的抗肿瘤作用广泛，对多种肿瘤细胞具有诱导凋亡的作用。因此，推测MDA-7/IL-24在不同的肿瘤细胞中可能存在不同的抗肿瘤机制。

　　4MDA-7/IL-24的抗肿瘤作用

　　4.1MDA-7/IL-24诱导多种肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤细胞生长MDA-7/IL-24的抗肿瘤研究始于对黑色素瘤细胞的研究。现已证实，MDA-7/IL-24可在人正常黑色素细胞和早期放射生长阶段(radial growth phase, RGP)的黑色素瘤细胞中表达，但随黑色素瘤恶性程度的增加，其表达水平逐渐下降，垂直生长阶段(vertical growth phase, VGP)的黑色素瘤细胞中很少表达MDA-7/IL-24，转移瘤中则检测不到[16]。用MDA-7/IL-24通过载体(质粒或复制缺陷的腺病毒Ad)转染人黑色素瘤细胞后发现其能保持黑色素瘤细胞的分化状态并诱导细胞出现凋亡，并且这种诱导凋亡作用不依赖于p53基因的状态。同样，将Ad.mda-7转染其他肿瘤细胞，如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌及恶性造血细胞等肿瘤组织中也得到了同样的结论，而同期转染的正常细胞则未出现凋亡[17-18]。由此推测，MDA-7/IL-24可能为一抑癌基因，其显著特点是促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长，而不影响正常细胞。在MDA-7乳腺癌小鼠模型的研究中[19]，转染MDA-7/IL-24的乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453、T47D及MDA-MB-157的生长被抑制，细胞停滞于G2/M期，而转染MDA-7的正常乳腺上皮细胞未出现生长抑制，将感染Ad.mda-7的MCF-7细胞植入裸鼠体内观察到形成的肿瘤体积小于对照组。同样，在人宫颈癌Hela细胞的体外实验[20]中，亦发现转染有Ad.mda-7的Hela细胞生长受抑制。将Hela细胞植入裸鼠皮下，成瘤后局部注射Ad.mda-7，观察肿瘤生长情况，发现注射Ad.mda-7组肿瘤平均体积明显小于对照组，组织切片有凋亡细胞出现。这说明Ad.mda-7有抑制肿瘤生长、促进其凋亡的作用。

　　4.2MDA-7/IL-24的抗肿瘤-旁杀伤效应胰腺癌是人类肿瘤中较为特殊的一种。研究发现，胰腺癌中约有85%～95%存在K-ras基因的突变[21]。SU等[22]用Ad.mda-7感染胰腺癌细胞株MIAPaCa-2(K-ras突变型)、PANC-1(K-ras突变型)、AsPc-1(K-ras突变型)和BxPC-3(K-ras野生型)，均未出现肿瘤细胞生长抑制及凋亡现象。应用反义(AS)K-ras的磷硫酸(PS)脱氧寡核苷酸(ODN)对胰腺癌细胞株处理后，在K-ras突变细胞株中可出现短暂的生长抑制，而野生型未出现。当联合应用Ad.mda-7和AS PSODN转染细胞后，在K-ras突变细胞株中出现了明显的生长抑制及肿瘤细胞凋亡，而野生型细胞株BxPC-3中未出现。检测单独感染Ad.mda-7的肿瘤细胞发现，MDA-7/IL-24 mRNA呈高水平转录，但蛋白为低水平表达。检测联合转染Ad.mda-7和AS PSODN的细胞发现，IL-24 mRNA和蛋白均高水平表达。由此推测这可能是由于K-ras干扰或阻断了MDA-7/IL-24蛋白的翻译。导入AS PSODN后，K-ras对MDA-7/IL-24翻译的阻断作用被解除，从而翻译出大量IL-24蛋白[23]。研究发现，联合使用K-ras蛋白激活抑制剂(ERK1/2)与Ad.mda-7作用胰腺癌细胞，得到了相似的结果，即出现MDA-7/IL-24蛋白大量合成，肿瘤细胞凋亡。SU等[22]在无胸腺裸鼠体内注射联合Ad.mda-7和AS PSODN作用的MIA PaCa-2细胞进行研究后意外发现，尽管Ad.mda-7和AS PSODN联合转染效率低(仅为8%左右)，但裸鼠肿瘤形成却被明显抑制。推测是由于联合转染后细胞表达的IL-24蛋白抑制了周围细胞的生长。据此SU等首次提出了MDA-7/IL-24抗肿瘤的旁杀伤效应。随后，SU等[24]采用一系列方法深入研究MDA-7/IL-24的抗肿瘤-旁杀伤效应。将感染Ad.mda-7的正常细胞(P69、PHFA-IM、FM516)或肿瘤细胞(DU-145、PC-3、Hela)分别与未感染Ad.mda-7的人宫颈癌Hela细胞进行共培养，观察未感染Ad.mda-7的Hela细胞的生长及凋亡情况。结果发现，共培养体系中未感染Ad.mda-7的Hela细胞出现生长抑制及细胞凋亡，感染后24h即可检测出共培养体系中有IL-24蛋白表达。感染Ad.mda-7的人前列腺癌PC-3与Hela的共培养体系中，IL-24蛋白分泌略延迟，Hela细胞的凋亡峰值出现在70h处。这可能与IL-24在PC-3细胞中合成延迟有关。在人黑色素瘤细胞研究中还发现，肿瘤细胞凋亡程度与蛋白的表达量存在剂量依赖关系，并且与肿瘤细胞表面功能性膜受体有关。根据以上结果推测，MDA-7/IL-24引起抗肿瘤-旁杀伤效应的机制可能是：细胞表达的成熟型IL-24蛋白与靶细胞膜表面受体IL-22R/IL-20R结合，激活JAK/STAT通路，使STAT1、STAT3发生磷酸化，上调Bax等凋亡相关蛋白，引发凋亡。尽管目前对此种解释仍存在争议，但多数肿瘤细胞表面存在IL-24蛋白的特异性受体支持此说法[25]。MDA-7/IL-24抗肿瘤-旁杀伤效应的提出引起了研究者们强烈的兴趣。设想采用稳定表达的载体将MDA-7/IL-24基因导入正常细胞后，细胞不会死亡并能够持久、稳定的表达IL-24，成熟的IL-24可以通过受体途径对邻近的肿瘤细胞及远处转移的肿瘤细胞发挥促凋亡的作用，抑制肿瘤的生长。同时，靶向治疗原发灶和转移灶是MDA-7/IL-24基因治疗的新亮点之一[26]。

　　4.3MDA-7/IL-24抑制肿瘤新生血管形成血管形成在肿瘤生长和转移中起着极其重要的作用，调控血管形成的因素颇多，尤以血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)备受关注。RAMESH等[23]在研究中发现，转染MDA-7/IL-24的血管内皮细胞HUVEC后血管状结构形成受到抑制。裸鼠体内非小细胞肺癌异种移植物试验亦发现，Ad.mda-7处理组中新生血管形成减少，VEGF和bFGF水平下调，抗肿瘤细胞生长作用明显[27]。RAMESH等[23]将IL-22R受体封闭，发现IL-24抑制新生血管形成能力明显下降，认为IL-24抑制新生血管形成可能与细胞膜表面IL-22R受体表达有关。他们还发现感染Ad.mda-7后的非小细胞肺癌侵袭能力明显下降。此外，其他研究还认为IL-24抑制肿瘤新生血管形成及转移可能是通过调控PI3K通路，下调PI3K、FAK及ILK-1实现的[28]。

　　4.4MDA-7/IL-24增强肿瘤放疗的敏感性非小细胞肺癌研究中发现转染MDA-7基因可以增强肿瘤细胞对放疗的敏感性[29]。随后发现，在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中也有同样的效果，并且MDA-7/IL-24增强放疗敏感性与肿瘤细胞p53基因状态无关[30]。SU等[31]还发现Ad.mda-7、IL-24蛋白和GST-Mda-7融合蛋白在恶性胶质母细胞瘤中均可增强肿瘤细胞对放疗的敏感性，诱导肿瘤细胞凋亡及生长抑制。肿瘤的放射性治疗是通过c-Jun途径使c-Jun及JNK蛋白水平上调，引起肿瘤细胞死亡，而MDA-7/IL-24则可能是通过激活JNK通路而使肿瘤细胞对放疗敏感性增高[32]。使用JNK1/2/3阻断剂SP600125后，前列腺癌中MDA-7/IL-24增强放疗敏感性的作用消失[33]，由此更证实了此种推断。

　　4.5MDA-7/IL-24的免疫调节作用CAUDELL等[34]发现人外周血单个核细胞经IL-24诱导48 h可分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-12和GM-CSF。同样处理，MDA-7/IL-24可诱导人黑色素细胞分泌IL-6、IFN-γ[35]。此外，在感染病毒influenza A/PR/8的单核细胞中发现MDA-7/IL-24 mRNA表达增加。推测MDA-7/IL-24可能参与了抗病毒的免疫反应。鉴于MDA-7/IL-24这种能够刺激人白细胞分泌二级细胞因子的作用，IL-24又被称为Th1细胞因子[34]。在MDA-7/IL-24的临床Ⅰ期实验中[36-37]，于肿瘤局部注射复制缺陷(敲除E1和E5基因)的Ad.mda-7(INGN-241)，第一轮治疗结束后发现成功感染的肿瘤细胞中有IL-24表达并且出现细胞凋亡，经治疗后患者体内CD3+和CD8+细胞反应性增多。提示出现Th1细胞因子应答。局部注射后周围组织表现为红斑，病理检查示病灶中广泛的淋巴细胞和浆细胞浸润[38]。IL-24与IL-10同属一个细胞因子家族，但功能上却存在着差异。前者主要抑制免疫应答及炎症反应，而后者为免疫调节分子，参与免疫应答的调控。IL-24诱导细胞因子的作用可以被IL-10部分或完全阻断。这可能与IL-10和IL-24共用细胞膜表面受体有关，并且IL-10与受体的结合力是IL-24的10倍[39]。IL-10和IL-24对细胞因子的诱导和抑制共同构成了一个复杂调节网络，并协调作用。总之，MDA-7/IL-24是目前发现的IL-10家族中唯一一个同时具备抑制肿瘤生长和免疫调节功能的细胞因子，为此备受基因治疗学家的青睐。

　　5MDA-7/IL-24促肿瘤细胞凋亡的分子途径

　　研究发现，MDA-7/IL-24可激活多种信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，并且在不同肿瘤细胞中激活的凋亡通路存在差异(图1)。

　　5.1JAK/STAT信号途径在黑色素瘤细胞的研究中，发现MDA-7/IL-24作用于细胞表面受体，引起JAK通路活化， STAT3蛋白被磷酸化激活，活化的STAT3向核移动;使用IL-24抗体可以阻断STAT3的向核移动[12]。然而，在SAUANE等[40-41]的研究中，使用酪氨酸激酶抑制剂及JAK特异性阻断剂AG490后MDA-7/IL-24的促肿瘤细胞凋亡作用仍存在。由此推断，JAK/STAT信号途径仅是MDA-7/IL-24促肿瘤细胞凋亡途径中的一种，可能还存在其他的信号途径。

　　5.2p38MAPK信号途径p38MAPK信号途径是目前MDA-7/IL-24较为认可的一个重要诱导凋亡途径。SARKAR等[42]在黑色素瘤细胞的研究中发现，腺病毒介导的MDA-7过表达可以使p38MAPK磷酸化激活，引起下游GADD(growth arrest and DNA damage)基因家族表达水平不同程度上调。GADD基因家族包括GADD34、GADD45α、GADD45β、GADD45γ和GADD153。其中以前三者水平上升最为明显，GADD153水平呈中度上升。上调的GADD可下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达，引起细胞凋亡。应用p38MAPK阻断剂SB203580后，GADD无升高，Ad.mda-7诱导的肿瘤细胞凋亡明显受限。同样，在多形性胶质母细胞瘤的研究中也观察到了p38MAPK信号途径诱导的细胞凋亡[31]。由此可见，p38MAPK途径调控GADD基因家族的表达在Ad.mda-7诱导细胞凋亡中起着重要作用。

　　5.3PKR信号途径PATAER等[43]在对肺癌的研究中发现，Ad.mda-7诱导肺癌细胞凋亡是通过上调RNA依赖的蛋白激酶 (double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR)实现的。磷酸化的PKR可以激活其下游通路上的eIF2α、Tyk2、STAT及p38MAPK途径分子。其中，Tyk2还可激活GADD153。由此推测，PKR信号途径与p38MAPK信号途径之间存在信号交流。随后，在对非小细胞肺癌的研究中又发现，感染Ad.mda-7后细胞中PKR蛋白表达明显增高，细胞凋亡显著，免疫荧光和免疫共沉淀示IL-24蛋白与PKR存在直接作用[44]。CHADA等[45-46]还发现感染Ad.mda-7的乳腺癌细胞，也能够通过PKR途径促进凋亡。但是，在黑色素瘤细胞研究中却发现，分泌型IL-24蛋白可通过膜受体介导细胞凋亡而不依赖于PKR、STAT3信号通路的激活[46]。图1MDA-7/IL-24抗肿瘤作用及其分子途径

　　5.4Fas-FasL信号途径GOPALAN等[47]发现卵巢癌细胞转染Ad.mda-7后，凋亡诱导物FasL与Fas相结合，随后FasL-Fas激活核因子κB，促进Fas相关因子1(Fas-associated 1)、Fas相关死亡区(Fas-associated death domain)和caspase-8表达。使用Fas配体抗体(NOK1)封闭FasL后，Ad.mda-7诱导的卵巢癌凋亡作用被阻断;用SiRNA技术封闭Fas后，Ad.mda-7诱导的细胞凋亡减弱。由此可见，MDA-7可通过激活Fas-FasL途径介导卵巢癌细胞的凋亡。

　　5.5β-catenin和PI3K信号途径MHASHILKAR等[28]发现，感染Ad.mda-7的乳腺癌和肺癌细胞中抑癌基因E-cadherin、APC、GSK-3β和PTEN表达增高，而促癌基因β-catenin水平降低。Ad.mda-7引起β-catenin由细胞核向细胞膜重新分布，导致T细胞因子/淋巴细胞增强因子(TCF/LEF)转录活性下调、PI3K途径信号分子(p85、PI3K、FAK、ILK-1、Akt和PLC-γ)表达水平下降，而与此拮抗的PTEN基因表达升高。由此可见，在乳腺癌细胞和肺癌细胞中Ad.mda-7的促凋亡作用可以通过β-catenin和PI3K信号途径实现。

　　5.6线粒体介导的细胞凋亡SU等[19]发现Ad.mda-7感染不同乳腺癌细胞株MCF-7(p53野生型)、MDA-MB-157(p53缺乏型)、MDA-MB-231(p53突变型)、MDA-MB-453(p53突变型)、T47D(p53突变型)后肿瘤细胞生长集落形成均减少，细胞凋亡明显。这种促凋亡作用是通过上调Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2比值实现的。与此同时，此试验证实在乳腺癌细胞中Ad.mda-7的凋亡诱导作用不依赖于细胞的p53基因状态。同时，转染Bcl-2或Ad.ELB后，Ad.mda-7的凋亡诱导作用可被抑制。同样，用Ad.mda-7感染黑色素瘤细胞后，发现Bcl-2、Bcl-xL表达减少[48];感染前列腺癌细胞株发现Bcl-2、Bcl-xL减少，Bak、Bax增多，Bak/Bcl-2、Bax/Bcl-xL比值上调[49]。并且不同细胞株中减少的抗凋亡基因存在差异：PC-3、DU-145细胞中，以Bcl-xL减少为主;而LNCaP中则以Bcl-2减少为主。由于线粒体Bcl-2蛋白家族还控制着线粒体的渗透转换和离子外流等(如细胞色素C途径)，因此IL-24引起的促凋亡和抑凋亡蛋白比值的改变，亦可能通过细胞色素C途径改变线粒体膜电位而诱发细胞凋亡。

　　LEBEDEVA等[50]还发现前列腺癌细胞株感染Ad.mda-7后，活性氧(reaction oxygen species, ROS)增加、线粒体功能紊乱，肿瘤细胞出现凋亡。正常情况下，位于线粒体内膜上的膜通透性转运孔蛋白周期性开放，使线粒体外室的质子能够回流入基质，从而防止质子在外室过度积聚，由此维持了线粒体跨膜电位(△ψ)的稳定[51]。转染Ad.mda-7后，前列腺癌细胞中ROS产物(包括单线态氧、超氧离子、氢氧化物、羟基等)增加，FACS检测显示其较对照组增加了3～5倍，而正常前列腺上皮细胞组中则未增加。增加的ROS产物导致癌细胞MPT持续开放，△ψ下降，细胞凋亡出现。通常△ψ下降早于细胞凋亡的形态学改变。使用抗氧化物N-乙酰-L-半胱氨酸、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸钠及通透转运孔阻断剂如米酵菌酸或环孢霉素A能够阻止细胞凋亡发生。相反，使用PK11195可激活MPT，引发凋亡。由此LEBEDEVA等[50]认为Ad.mda-7感染的前列腺癌细胞中，MDA-7/IL-24可直接或间接地引起线粒体功能紊乱，介导前列腺癌细胞凋亡。

　　5.7MDA-7/IL-24与内质网应激内质网应激是由多种原因(如缺氧、饥饿、内质网腔内钙离子失衡、异常折叠蛋白在内质网堆积等)引发的从内质网到胞质和胞核的一系列信号转导过程。它可通过触发未折叠蛋白反应、内质网过载反应及未折叠内质网相关蛋白降解等途径的适度激活进行调解，使细胞免于凋亡。然而，过度的内质网应激最终会导致细胞凋亡[52]。SAUANE等[41]研究发现感染Ad.mda-7的前列腺癌细胞中，IL-24蛋白积聚于内质网及高尔基体，激活的GADD基因家族可能与内质网应激有关。此外，感染Ad.mda-7的非小细胞肺癌细胞株H1299细胞中发现IP3R水平上调，而后者与内质网腔钙释放有关。因此，推测MDA-7/IL-24诱导细胞凋亡可能与内质网应激有关。为进一步明确内质网应激是否是由特异性MDA-7/IL-24蛋白在内质网积聚而引起的，SIEGER等[53]采用Ad.vec作为Ad.mda-7的对照分别感染人肺癌细胞株H1299，同时使用分泌阻断剂后发现，Ad.vec组未引起细胞凋亡，而Ad.mda-7组细胞凋亡明显。这种凋亡是由过度异位表达的MDA-7/IL-24蛋白在内质网积聚引起的。YACOUB等[54-57]在脑胶质瘤的研究中发现，GST-MDA-7融合蛋白对胶质瘤细胞的杀伤作用依赖caspase、cathepsin和PERK(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase)实现，后者是内质网应激和未折叠蛋白应答启动的标志之一。当融合蛋白GST-MDA-7存在时，其抑制细胞外信号调节激酶(ERK1/2)途径并激活JNK1-3途径，后者上调Bax的表达，促进肿瘤细胞凋亡。PERK-/-的细胞中GST-MDA-7对肿瘤细胞的杀伤作用受抑制。由此可见，内质网应激与线粒体及细胞内多种信号途径间存在信号交流。

　　此外，在黑色素瘤的研究中还发现MDA-7/IL-24可通过激活Ⅰ型干扰素(IFN-β)杀伤肿瘤细胞[58]。将黑色素瘤细胞与转染MDA-7的HEK293细胞共培养后发现，黑色素瘤细胞内源性干扰素调节因子-1(IRF-1) 的表达下降、IRF-2的表达升高并同时激活TRAIL/FasL途径，肿瘤细胞发生凋亡。

　　总而言之，目前公认的诱导细胞凋亡的方式有两种，即受体介导的凋亡途径和细胞内引发的凋亡途径。既往认为MDA-7/IL-24是通过IL-24分泌型蛋白与细胞膜表面特异性受体结合，配体-受体复合物激活JAK/STAT、caspase-8等信号途径发挥诱导细胞凋亡的作用。但是，目前已有的研究可以充分证实，MDA-7/IL-24诱导的肿瘤细胞凋亡作用并非绝对是受体依赖的[53-59]，并且其在不同肿瘤细胞中存在多种信号途径促进肿瘤细胞发生凋亡，进一步说明MDA-7/IL-24抑制肿瘤作用的广泛性。

　　6MDA-7/IL-24的临床Ⅰ期试验

　　在大量前期工作的基础上MDA-7/IL-24的基因治疗制剂现已进入临床Ⅰ期试验阶段[36,60-61]。INGN-241是由Invitrogen Therapeutics公司与德克萨斯大学合作研制的一种表达MDA-7/IL-24基因的腺病毒复制缺陷型基因治疗制剂。临床Ⅰ期试验期间，于肿瘤局部注射INGN-241后70%的癌组织中均可检测到MDA-7/IL-24表达增加及明显的细胞凋亡，与之前进行的p53基因治疗相比，MDA-7/IL-24基因促肿瘤细胞死亡的作用更显著[26]。注射后患者血中IL-6和TNF-α水平增高，接受反复注射者增高更明显，且接受治疗的患者体内CD3+和CD8+T细胞增多，说明MDA-7/IL-24不仅可直接诱导肿瘤细胞凋亡，还可通过免疫调节、促Th细胞和CD8+T细胞激活间接发挥抗肿瘤作用。治疗过程中患者对INGN-241耐受性好，不良反应小。

　　7问题与展望

　　MDA-7/IL-24作为一种细胞因子型抑癌基因，是IL-10家族中唯一一个抑癌基因，也是目前已知的唯一一种既能抑制肿瘤生长又能刺激免疫系统发挥抗肿瘤作用的基因，抑制肿瘤生长的同时对正常细胞没有影响。这些特性使MDA-7/IL-24成为极具前景的肿瘤治疗基因之一[56]。但是，MDA-7/IL-24相关基础性研究有待完善，如MDA-7/IL-24诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无影响是如何调控实现的，抗肿瘤的旁杀伤效应是否是绝对受体依赖的，不同肿瘤细胞中多种促凋亡途径在不同肿瘤细胞中的整合和交流情况是怎样的，外源性MDA-7蛋白在不同肿瘤细胞中促凋亡作用如何，异位表达的IL-24蛋白对各种抑癌基因是怎样调控，如何将 MDA-7/IL-24基因制备成长期、稳定、高效表达的生物制剂以用于肿瘤基因治疗等，已成为亟待解决的问题。

　　总之，MDA-7/IL-24已具备基因治疗的基本特性，但若想成为高效的治疗基因，还应在基因转入方式、抗肿瘤能力、基因表达效率及持久性上再下功夫。相信在不久的将来，MDA-7/IL-24这种具有多种抗肿瘤功能的细胞因子必将成为肿瘤基因治疗的新武器。

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