通脉口服液抗肾小管间质纤维化作用研究

　　【摘要】 目的 探讨益气活血中药复方通脉口服液对肾小管间质纤维化的干预作用。方法 采用单侧输尿管结扎致肾小管间质纤维化模型，同时制备中医气虚血瘀模型，实验共分6组，分别为空白对照组、模型组、洛汀新组、通脉口服液高、中、低剂量组。观察实验大鼠用药前后证候积分、血清肌酐及尿素氮的水平、梗阻侧肾间质慢性病变(包括肾小管萎缩和间质纤维化)评分(atrophy and fibrosis score，AFS) 、肾间质细胞浸润情况评分CIS(cell infiltration score，CIS)。结果 通脉口服液可明显改善实验大鼠的症状，明显减轻肾组织纤维化的病理形态，降低纤维化指数，疗效优于洛汀新组。结论 通脉口服液具有一定的抗肾小管间质纤维化作用。

　　【关键词】 通脉口服液;益气活血;肾小管间质纤维化

　　A study of effects of Tongmai oral suspension against renal tubulointerstitial fibrosis (TIF)

　　PIAO Shenghua1,YANG Nizhi2

　　(1.Academy of Chinese Medicine,Guangdong Pharmaceutical College,Guangzhou,Guangdong 510006,China; 2.Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou，Guangdong 510120,China)Abstract:Objective to discuss the intervention of the compound prescription of Tongmai oral suspension with the function of tonifying qi and promoting blood flow on renal tubulointerstitial fibrosis (TIF).Methods Rat models with renal tubulointerstitial fibrosis (TIF) and Qi deficiency and blood stasis were made with unilateral ureteral occlusion (UUO),and rat model of blood stasis due to qi deficiency was also made. The rats were randomized into six groups,i.e.,blank control group,model groups,the group administered with Lotensin,and the groups administered with Tongmai oral suspension at high,moderate,and low doses. Syndrome scoring,serum creatinine (SCR),blood urea nitrogen (BUN),and scoring of chronic pathological changes of renal interstitium including tubular atrophy and interstitial fibrosis,and scoring of interstitial cell infiltration were observed.Results Tongmai oral suspension could improve symptoms of rats in the experiment,significantly improving the pathomorphism of renal interstitial fibrosis,lowering tubulointerstitial fibrosis index (TFI),with effects better than those of Lotensin.Conclusion Tongmai oral suspension could delay tubulointerstitial fibrosis.

　　Key words:Tongmai oral suspension; benefiting vital energy to promot blood circulation; 　　renal　tubulointerstitial fibrosis (TIF)

　　肾脏纤维化是多种肾脏疾病走向肾衰竭的共同病理过程，其发病机制至今尚未明确，为多因素综合作用的结果。目前，尚无有效的治疗方法，只能采取对症治疗。在中医理论指导下的中药复方制剂，由于其多中心、多靶点的治疗机理，在对复杂病机的疾病防治上体现了一定的优势。杨霓芝教授在多年临床经验基础上，提出益气活血法抗肾纤维化，并研制了院内制剂通脉口服液临床用于治疗慢性肾炎，防治肾小球纤维化，取得了很好的临床疗效[1-4]。本研究在气虚血瘀模型基础上单侧输尿管结扎(unilateral ureteral occlusion,UUO)制备肾小管间质纤维化模型，通过观察用药前后症状积分、肾小管萎缩和间质纤维化评分(atrophy and fibrosis score，AFS)、肾间质细胞浸润情况评分 (scoring of interstitial cell infiltration，CIS)等指标评价中药复方通脉口服液对肾小管间质纤维化的疗效。

　　1 材料和方法

　　1.1 药物

　　受试药物：通脉口服液(TM)，由黄芪、三七等组成，由广东省中医院制剂中心提供，批号:20070506;阳性对照药：苯那普利(商品名：洛汀新)，北京诺华制药有限公司生产，批号：国药准字X0267，规格为10 mg/片;造模用药物：D半乳糖、5%(φ)水合氯醛,广州威佳生物科技有限公司提供。

　　1.2 实验动物

　　Wistar大鼠，雄性，体质量230～250 g，广州中医药大学动物室提供，合格证号:SCXK(粤)20030001。

　　1.3 仪器

　　Leiz型轮转切片机(德国LEIZ公司);LKBV超薄切片机(瑞典LKB公司);电光源显微镜(日本Olympus公司); 荧光显微镜(上海第二光学仪器厂)。

　　1.4 模型制备

　　1.4.1 气虚血瘀模型的制备[5] 大鼠适应性喂养3 d(d1～d3)后，衰老和疲劳造模同时进行。①衰老：实验第4天至第35天(d4～d35)各组大鼠每日上午9:00左右皮下注射D半乳糖，剂量48 mg/kg，以造成大鼠亚急性衰老模型;②疲劳：d4～d35，实验大鼠每日14:00开始分批置入直径50 cm，高100 cm水桶内，桶内水深约45 cm，水温与室温均保持为(10±0.5) ℃ 。以木棒拔打强迫其不断游泳直到疲劳，时间长短存在个体差异，平均为(10±5)min。第36天进行UUO模型的制备，第37天(给药前)进行大鼠气虚、血瘀证症状积分的记录。

　　1.4.2 UUO动物模型的制作[6] 实验第36天(d36)腹腔注射5%(φ)的水合氯醛，将大鼠麻醉后局部剃毛，常规消毒铺孔巾，选择腹正中线切口稍偏左，依次切开皮肤至腹腔，游离肾脏及输尿管，将左侧输尿管用组织钳托起中段部位，止血钳夹住，在两端用4.0丝线结扎左侧输尿管近肾盂段及远端，在两个结扎点之间剪断输尿管，然后用4.0丝线连续缝合肌肉、皮肤。假手术组即空白对照组(A)大鼠手术入路方式同UUO组，进腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管。

　　1.5 实验分组及给药

　　实验第37天，将上述方法制备成的气虚血瘀UUO大鼠随机分为假手术组即空白对照组(A)、模型组(B)、洛汀新组(C)、中药低剂量组(D)、中药中剂量组(E)、中药高剂量组(F)。在进行大鼠气虚、血瘀证症状积分的记录后，A、B组大鼠d37～d57生理盐水灌胃;C组大鼠d37～d57洛汀新(10 mg·kg-1·d-1)灌胃;D组大鼠d37～d57 TM(4 mL·kg-1·d-1)灌胃;E组大鼠d37～d57 TM(8 mL·kg-1·d-1)灌胃;F组大鼠d37～d57 TM(16 mL·kg-1·d-1)灌胃。

　　1.6 标本收集与取材

　　实验第58天，各组大鼠腹主动脉取血制备血清，-70 ℃冰箱保存待测肾功能指标，梗阻侧经肾门正切的肾组织用10%(φ)多聚甲醛溶液固定，常规方法制备切片待检。

　　1.7 观测指标

　　1.7.1 大鼠气虚血瘀证宏观表现评价[5] 通过大鼠气虚证辨证量表和大鼠血瘀证辨证量表，分别于第37、57天对各组大鼠进行症状积分评定。见表1。

　　1.7.2 肾组织病理学检测

　　1.7.2.1 HE染色 两个观察者对每个样本肾组织的HE染色进行盲法评分，取两观察者评分的平均值，代表各样品的肾小管间质损伤程度。

　　1.7.2.2 AFS评价 200倍光镜下双盲法随机取互不重叠的10个视野。间质纤维化：无(0分)、小于相应视野区域25%(1分)、相应视野25%～50%(2分)、大于相应视野50%(3分);肾小管萎缩：无(0分)、小于相应视野区域25%(1分)、应视野25%～50%(2分)、大于相应视野50%(3分)。

　　1.7.2.3 CIS评价 200倍光镜下双盲法随机选取互不重叠的10个视野。间质细胞浸润：无(0分)、局灶细胞浸润(1分)、多灶细胞浸润(2分)、弥漫细胞浸润(3分)(见图1)。

　　1.7.2.4 肾小管间质纤维化指数评价 采用北航医学图像采集和分析系统软件，对Masson染色肾组织切片，在同一条件下对每张标本选取15个不重复视野(40×)，将呈现为蓝色的纤维区域(去除肾小球和大血管)视作阳性目标，以阳性面积与统计场总面积的比值作为肾小管间质的纤维化指数(见图2)。

　　1.8 统计学方法

　　所有结果采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析处理，计量资料采用方差分析和q检验，以P<0.05为差异有显著性。表1 大鼠气虚、血虚证辨证量表

　　大鼠气虚证辨证症状积分大鼠血瘀证辨证症状积分A精神萎顿3A舌质暗淡3 倦怠嗜睡5 舌质绛紫5 对抗性、攻击性完全消失7B毛发枯黄无润泽3B眼球由淡红转为深红3 毛发结穗打卷5 转为暗红5 毛发稀疏脱落7C尾尖至根部出现轻度瘀血点3C轻度稀便3 尾尖至根部出现中度以上瘀斑5 中度稀便5 重度稀便或黄绿褐色黏臭便7

　　2 结果

　　2.1 治疗前后中医症状积分 结果见表2、3。给药前(d37)各组大鼠的气虚血瘀证积分均较空白对照组明显升高(P<0.01)，给药后(d57)通脉口服液各剂量组气虚血瘀证积分与模型组比较均有不同程度改善(P<0.01)，但洛汀新组气虚血瘀证积分与模型组比较无明显改善(P>0.05)

　　2.2 通脉口服液对各组实验性大鼠肌酐、尿素氮的影响 结果见表4。与空白组比较，模型组的血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)均有明显升高(P<0.05)，说明模型成功。治疗后，各用药组与模型组比较均有不同程度的降低，但仅有洛汀新组和模型组比较差异有显著性(P<0.05)。表2 给药前后各组气虚证症状积分比较表3 给药前后血瘀证积分比较与空白组比较：△P<0.01;与模型组比较：▲P<0.01;与洛汀新组比较：※P<0.01表4 给药后各组大鼠肌酐、尿素氮比较

　　2.3 对实验性UUO大鼠肾间质慢性病变AFS、CIS及纤维化指数的影响 结果见表5、表6。治疗结束时(57 d)与空白组相比，各组AFS、CIS积分均明显增高(P<0.05)，说明造模成功;与模型组比较，各用药组AFS、CIS积分均有不同程度的降低，其中通脉高剂量组与洛汀新组改善最为显著(P<0.05);与洛汀新组比较，通脉高剂量组在改善AFS上优于洛汀新组(P<0.05)。表5 给药后各组大鼠肾小管萎缩和间质纤维化(AFS)比较

　　3 讨论

　　3.1 对气虚血瘀模型大鼠证候表现的影响

　　本研究气虚血瘀证模型建立与评价是依据中医证候模型研究“生物表征”理论及“因、脉、证、治”建模思路[1]。生物表征即气虚血瘀证动物模型的外观表征，包括活动状态、皮毛、眼、爪甲、耳、鼻、唇及舌的色泽。“因”指引起气虚血瘀之因，如游泳疲劳造成气虚等;“脉”指造模之果，即气虚血瘀证动物模型的生物表征，动物所表现在外的气虚状态与血瘀表现;“证”指造模原理，根据中医辨证理论对造模的“因”“果”关系进行的概括;“治”指以方测证，即采用益气活血药对气虚血瘀证动物进行治疗是否有效反证动物的证候属性。通过制定大鼠气虚血瘀证量表，对造模后大鼠用药前后的外观表征均进行了统计学分析，结果表明，通脉口服液具有改善气虚血瘀证大鼠的一般状态的作用，而洛汀新则不具备此作用，体现了中药复方治疗疾病的优势所在。

　　3.2 对大鼠肾功能影响的评价

　　血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)作为评价肾功能的血清学指标，临床应用广泛，简便易行。本研究结果表明，在限定时间即20 d内，洛汀新在改善肾功能(Scr、BUN)方面的作用优于通脉组，这可能与洛汀新可通过RAS系统抑制AngⅡ的生物学作用、提高HGF的表达、减少尿蛋白量、减轻系膜细胞中蛋白质的流动或降低血脂浓度及血小板的高凝集性等多方面的因素有关，从而在短期内达到了保护肾功能的作用，作用速度较快。但在临床上患者难以长期维持使用洛汀新，而且当肾功能衰竭进展到一定程度，应用ACEI类药物将不具有保护肾功能的作用，反而加重肾功能的损害。另外，部分适用患者因其副作用较大，也不得不停止使用。通脉口服液中的黄芪具有良好的双向免疫调节作用，可以改善患者体内的免疫状态，这在我们前期的实验中已经得到证实[4];活血化瘀药三七也具有明显的改善血流动力学、改善肾组织内局部微循环、凝血纤溶状态的作用。但中药起效可能需较长时间，不能在短期内(20 d)达到和洛汀新同样改善肾功能的作用。临床上通脉口服液治疗慢性肾炎的疗程也为2个月[1-4]，可起到较好地降低蛋白尿、保护肾功能的作用。且经过前期的长期毒性、急性毒性研究表明，该药物无明显毒副作用，患者耐受性、依从性好，可以长期服用。

　　3.3 对大鼠梗阻侧肾组织病理形态学观察及纤维化指数的评价

　　病理学是研究肾脏疾病最直观、最有说服力的指标，也是临床上进行肾脏病诊断的金指标。本研究根据UUO致大鼠肾小管间质纤维化的需求，对实验大鼠行HE、Masson染色，进行病理形态观察，通过对大鼠肾间质慢性病变(AFS)和肾间质细胞浸润情况(CIS)进行观察评分，并进行了统计学分析。结果表明，通脉口服液可一定程度上减轻模型大鼠的肾小管间质纤维化，且有剂量依赖性。

　　综上所述，益气活血中药复方通脉口服液在减少模型大鼠证候积分、改善模型大鼠肾组织病理形态方面具有优势，从而起到抗UUO大鼠肾小管间质纤维化作用，保护肾功能，为其临床扩大主治范畴奠定良好的基础。但其抗肾小管间质纤维化、保护肾功能的确切疗效还有待于今后大规模随机、双盲、对照的临床研究。

　　【参考文献】

　　[1] 王丽新,杨霓之.通脉口服液对慢性肾炎血液流变学的影响[J].黑龙江中医,1997(4):47-48.

　　[2] 王丽新,杨霓之,包昆,等.通脉口服液对慢性肾炎气血血瘀证免疫功能的影响[J].中医药研究,2000,16(5):16-18.

　　[3] 杨霓之,王丽新,林启展,等.通脉口服液治疗慢性肾炎气虚血瘀证32例临床观察[J].新中医,2003,35 (1)：19-21.

　　[4] 王立新，赵代鑫，杨霓之.益气活血法治疗慢性肾炎60例临床观察[J]. 广州中医药大学学报，2006，23(3)：122-126.

　　[5] 田金洲，王永炎，时晶，等.证候模型研究的思路[J].北京中医药大学学报，2005(5)：25-27.

　　[6] CHEVALIER R L,THORNHILL B A,CHANG A Y,et al. Recovery from release of ureteral obstruction in the rat: Relationship to nephrogenesis[J]. Kidney Int,2002,61(6):2033-2043.