库仑电化学法快速测定单胺类神经递质的方法学研究

　　【摘要】 目的 建立库仑阵列电化学高效液相色谱法快速测定大鼠脑组织中的单胺类神经递质的含量。方法 采用库仑阵列电化学检测器检测去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羟色胺(5HT)、5羟吲哚乙酸(5HIAA)，采用Phenomenex C18反相色谱柱(150 mm×4.60 mm，5 μm)，流动相为缓冲液乙腈(体积比87∶13)，流速为1 mL·min-1，柱温为35 ℃。结果 4种单胺类神经递质的最低检测限为0.015 15～0.018 15 ng ,回收率为85.3 %～100.5 %。结论 该法具有快速、准确、灵敏、样品制备简便等优点，可用于大鼠脑组织中单胺类神经递质的分离检测。

　　【关键词】 高效液相色谱法;单胺类神经递质;库仑阵列电化学检测器

　　Rapid determination of monoamine neurotransmitters by high performance liquid chromatographic analysis with coularray detector

　　XIAO Fengxia1，DENG Shaodong1，TIAN Qing2,DENG Chaoming1，ZHOU Gailian1

　　(1.School of TCM,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou Guangdong 510006,China; 2.Taishan Medical University,Taian,Shandong 271016,China)Abstract:Objective To establish a rapid method for determining monoamine neurotransmitters in rats’ brain tissue by HPLC with coularray detector.Methods HPLC was performed on a Phenomenex C18 column(150×4.60 mm,5 micron). The mobile phase,consisted of acetonitrilewater phase(13∶87),was at a flowrate of 1 mL·min-1. The column temperature was kept at 35 ℃. The levels of NE,DA,5HT and 5HIAA were determined.Results The minimum measurement limit was 0.015 15-0.018 15 ng. The average recoveries were 85.3 %-100.5%.Conclusion This method is rapid,accurate,highly sensitive and easy to operate. The procedure is suitable for determining the monoamine neurotransmitters in rats’ brain tissue.

　　Key words:HPLC; monoamine neurotransmitters; coularray detector

　　单胺类物质包括去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羟色胺(5HT)、五羟吲哚乙酸(5HIAA)等物质，是哺乳动物和人类中枢神经重要的信息传递物质。研究该类物质及其代谢产物在体内的含量变化，对于阐明药物在体内的作用机制，提供了有力的依据。尤其在老年痴呆症、抑郁症、儿童多动症、儿童多动秽语综合征等疾病与神经递质含量关系、药物治疗效果等方面的研究中，可提供非常有用的信息[1]。目前文献报道此类物质常见的检测方法主要有高效液相色谱电化学检测器测定法(HPLCECD)、荧光法、放射酶学分析法等[2]。其中以HPLCECD测定法报道的较多，但现有的HPLCECD测定法存在流动相成分复杂[3]、重现性差、检测时间长、样品前处理不彻底等问题。本研究改进了现有的测定方法，建立起一种流动相单一、重现性好、检测时间短、样品处理完全,并可同时测定4种单胺类物质及其代谢产物的检测方法。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器

　　库仑阵列电化学高效液相色谱仪[Model 5600A16通道检测器(美国ESA公司)，Model 582 solvent Delivery System，Model 542 自动进样器，CoularrayWin工作站]，Dionex Tcc100型柱温箱(美国戴安公司);Thermo D37520型高速冷冻离心机(德国Heraeus公司);pHS25型pH计(上海精密科学仪器有限公司);GenPure超纯水系统(德国TKA公司);KQ500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率500 W,频率40 kHz);3 K超滤管(PALL公司);BP211D电子天平 (德国Sartorious);佳美SK1快速混匀器(江苏金坛市佳美仪器厂);玻璃匀浆器。

　　1.2 试药

　　去甲肾上腺素(NE，批号100169199402)、多巴胺(DA，批号100070200405)、5羟色胺(5HT，批号111656200401)、5羟基吲哚乙酸(5HIAA，批号140737200501) 均购自中国药品生物制品检定所;水为超纯水，乙腈为色谱纯(德国默克公司)，其余试剂均为分析纯。

　　1.3 动物

　　SPF级SD大鼠12只，雌雄各半,体质量(180±20) g，由广州中医药大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK(粤)20080020]。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件

　　色谱柱：Luna C18柱(Phenomenex，150 mm×4.60 mm，5 μm)，Alltima C18预柱(Alltech,7.5 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：缓冲液[每1 L超纯水中含乙二胺四乙酸二钠(EDTA)37.2 mg、NaH2PO4 31.2 g、辛烷磺酸钠1 g，pH值4.0]∶乙腈=87∶13，流速：1 mL·min-1;柱温箱：35 ℃;自动进样器温度：4 ℃;检测电压：350 mV;进样量：15 μL。

　　2.2 溶液的制备

　　2.2.1 蛋白沉淀工作液的制备 取HCLO4 4.29 mL，加水稀释至500 mL，得到0.1 mol·L-1 HCLO4溶液，用0.22 μm滤膜滤过，即得。

　　2.2.2 混合对照品贮备液的制备 精密称取NE、DA、5HT、5HIAA对照品各1 000 μg，用0.1 mol·L-1 HCLO4定容至2 mL容量瓶中，使其质量浓度均为500 μg·mL-1。取以上4种对照品溶液各500 μL混匀，配制成各对照品质量浓度均为125 μg·mL-1的混合对照品贮备液。

　　2.2.3 缓冲液的制备 取EDTA 37.2 mg(0.1 mmol·L-1)、NaH2PO431.2 g(0.2 mol·L-1)、辛烷磺酸钠1 g溶解于1 L 超纯水中,H3PO4调pH值至4.0。

　　2.2.4 供试品溶液的制备 取大鼠禁食12 h后，断头处死,在冰台上迅速分离出大脑组织。将标本称质量后,锡纸包好，脑组织作为实验样品保存于-80 ℃冰箱中。称取脑组织0.2 g，加入0.1 mol·L-1 HCLO4溶液1 mL，冰浴匀浆。匀浆液涡旋混匀后置4 ℃高速冷冻离心机中12 000 r·min-1离心10 min，取上清液置3 K超滤管中进行二次离心，超滤后清液作为供试品溶液。

　　2.3 系统适应性试验

　　精密吸取蛋白沉淀工作液、混合对照品贮备液、供试品溶液各15 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见图1。脑组织样品中的NE、DA、5HIAA和5HT得到了良好的分离,保留时间分别为2.91、4.36、5.02 和8.34 min，其他杂质不干扰测定结果。

　　2.4 线性关系考察

　　取混合对照品贮备液适量，置6个容量瓶中，分别加入0.1 mol·L-1 HCLO4稀释成不同质量浓度的系列混合对照品溶液，使所含各对照品的质量浓度分别为0.004、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 μg·mL-1,分别精密吸取15 μL 进样。以各组分的质量浓度(ρ)为横坐标,各组分的峰面积(A)为纵坐标进行线性回归,4种单胺类神经递质的线性关系考察结果见表1。表1 4种单胺类神经递质的线性关系考察结果

　　2.5 精密度试验

　　分别配制低(0.02 μg·mL-1)、中(0.5 μg·mL-1)、高(2.5 μg·mL-1)3种不同质量浓度的混合对照品溶液,分装后贮存于-80 ℃冰箱内。日内连续测5次,计算日内精密度;每份样本每日测5次,连续测定5日,计算日间精密度，见表2。

　　2.6 稳定性试验

　　取供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h进样10 μL，计算各组分峰面积积分值RSD值，分别为1.18%(NE)、3.55%(DA)、1.19%(5HIAA)、0.87%(5HT)，表明供试品溶液在4 ℃条件下放置24 h稳定性良好。

　　2.7 加样回收率实验

　　取大鼠脑组织,经预处理后测定峰面积。再取上述脑组织分别加入低(0.02 μg·mL-1)、中(0.5 μg·mL-1)、高(2.5 μg·mL-1)3种浓度的混合对照品溶液，按照“2.2.4”项下方法制备加样回收供试品溶液，依法测定，计算回收率，结果见表2。表2 回收率与日内、 日间精密度

　　2.8 检测限测定

　　取“2.4”项下配制的混合对照品溶液(0.004 μg· mL-1)不断用0.1 mol·L-1 HCLO4稀释，进样15 μL，依法测定。以信噪比S/N≥3∶1 时样品进样量为该条件下的检测限，测得各神经递质的检测限分别0.018 15(NE)、0.016 05(DA)、0.016 8(5HIAA)、0.015 15(5HT)ng。

　　3 讨论

　　3.1 样品处理方法的选择 在实验过程中发现只用HCLO4处理样品后即进样测定，柱压会逐渐上升，甚至造成在线过滤器及电极的堵塞。因此在处理脑组织样品时，采用超滤管进行二次离心除蛋白，在提高样品的纯度的同时，可减少其对色谱柱及仪器的损害。

　　3.2 电压值的选择 本研究考察了4种神经递质在-100～600 mV电压范围内进行测定的效果。结果在350 mV电压条件下峰高与电压比均较大，且基线噪音较小，符合含量测定的要求，因此选用此电压作为工作电压。

　　3.3 色谱条件的选择 经前期摸索，发现柱温、流动相pH值、有机相与水相的配比变化均会影响4种单胺类神经递质的分离情况。柱温升高,流动相黏度降低,各组分保留时间均缩短。流动相pH值对5HIAA和5HT的影响较大，而对其它2种神经递质影响较小，pH值降低可使 5HIAA的保留时间延长，而5HT 的保留时间缩短,NE、DA保留时间变化不大，但各化合物变化幅度不同，因此应将pH值调至固定值。有机相与水相的配比则影响各物质的保留时间及分离度，加大乙腈的量可以明显缩短分析时间，尤其对5HT影响较大。而因为较高的柱温和较低的流动相pH值将对仪器及色谱柱造成影响,故在满足分离的情况下,本实验采用了35 ℃的柱温、用H3PO4调节pH值至4.0的流动相，同时为了缩短检测时间将乙腈的比例提高至13%。

　　本实验建立的方法可以在10 min 内完成生物样品中4种单胺类神经递质的测定,并可得到较准确的测定结果。此方法与文献报道的方法相比具有流动相单一、重现性好、检测时间短、样品处理完全等优点，可用于临床上疾病的诊断以及新药开发过程中的药效研究。

　　【参考文献】

　　[1] 谭炳炎,郑琳,冯翔.高效液相色谱/电化学法测定大鼠血液和脑组织中单胺类物质的含量[J].分析测试学报,2006,25(2):90-92.

　　[2] 刘明志,朱业湘.儿茶酚胺类神经递质检测技术及其研究进展[J].中国卫生检验杂志,2002,12(4):501-503.

　　[3] 张向晖,刘军,苏林雁.库仑阵列电化学高效液相色谱法测定大鼠脑组织中单胺类神经递质及代谢产物[J].医学临床研究,2007,24(1):1-3.