姜黄素与依那普利对大鼠肾小管上皮细胞转分化影响的对比研究

　　【摘要】 目的 探讨姜黄素对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾小管上皮细胞转分化的作用。方法 采用UUO致肾间质纤维化大鼠模型。将大鼠随机分为假手术组、模型组、姜黄素组、依那普利组。从造模后第2天起,姜黄素组、依那普利组分别给予100 mg/(kg·d)姜黄素、10 mg/(kg·d)依那普利腹腔注射。术后第4周,处死各组大鼠,用HE、Masson染色评定肾小管间质纤维化程度;用免疫组化方法检测肾组织内转化生长因子β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)的表达部位及蛋白表达水平。结果 与假手术组相比,模型组大鼠血清尿素氮水平显著增加(P<0.01),肾间质纤维组织相对面积显著扩大(P<0.01),肾组织内TGF-β1、α-SMA、Vimentin表达均显著上调(P<0.01)。姜黄素或依那普利干预后,上述上调指标都被显著抑制(P<0.05或0.01)。两种药物之间比较,作用无显著性差异(P>0.05)。结论 姜黄素及依那普利可能通过抑制UUO大鼠肾小管上皮细胞转分化而减轻肾间质纤维化。

　　【关键词】 姜黄素;依那普利;α-平滑肌肌动蛋白;波形蛋白;肾小管上皮细胞转分化;大鼠

　　Comparative Study on the Effects between Curcumin and Eenalapril on Transdifferentiation of Renal Tubular Epithelial Cells in Unilateral Ureteral Obstruction Rats

　　ZHAO Ai-qing, ZHANG Xiao-ming, HOU HENG, et a

　　Department of Medicine, Medical School of Datong University, Datong 037008, China

　　Abstract：Objective To compare the effects of curcumin and enalapril on transdifferentiation of renal tubular epithelial cells in unilateral ureteral obstruction (UUO) rats. Method UUO rat model was used. Male wistar rats were randomly divided into four groups with 8 rats each：shame-operated group (0.9% saline solution), model group (dimethyl sulphoxide), curcumin treatment group [curcumin 100 mg/(kg·d)], and enalapril treatment group [enalapril 10 mg/(kg·d)]. Medicines were given intraperitoneally daily two days after the operation. All rats were killed 4w after surgery. The degree of tubulointerstitial fibrosis was scored by HE and Masson staining, and the sites and levels of protein expression of TGF-β1、α-SMA and vimentin were detected by immunohistochemistry staining. Result Compared with shame-operated group, the serum urea nitrogen level was significantly increased (P<0.01), and the relative area of interstitial fibrosis was also significantly enlarged in the model group (P<0.01), the expression of TGF-β1、α-SMA and Vimentin protein was significantly up-regulated in their kidney tissue (P<0.01). After intervention with curcumin or enalapril, the up-regulation of the above-mentioned parameters were all significantly inhibited (P<0.05 or 0.01). There was no significant difference of intervention effects between curcumin and enalapril (P>0.05). Conclusion The pharmacological effects of curcumin and enalapril may be partly mediated by inhibiting the transdifferentiation of renal tubular epithelial cells towards myofibroblast in UUO rats.

　　Key words：Curcumin;enalapril;α-SMA;vimentin;tubular epithelial transdifferentiation;rat

　　姜黄素(Curcumin)是从姜科植物姜黄中提取的一种植物多酚,也是姜黄发挥药理作用最重要的活性成分。近年研究表明[1-2],姜黄素对多种原因所致的肾损害及糖尿病大鼠肾脏都具有保护作用。在大鼠动物模型中,可明显减轻肺纤维化、肝纤维化程度[3-4]。但姜黄素能否减轻单侧输尿管梗阻模型(UUO)大鼠肾间质纤维化?其机制是否与抑制肾小管上皮细胞转分化有关?本实验拟用UUO大鼠模型对此做一探讨,并将其与依那普利进行比较。现将结果报道如下。

　　1 实验材料

　　1.1 主要试剂

　　兔抗大鼠转化生长因子β1(TGF-β1)多克隆抗体(1∶50)、小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体(1∶100)、小鼠抗大鼠波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体(1∶100)、生物素化山羊抗小鼠IgG,链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物工作液,二甲基邻苯二胺(DAB)显色试剂均购自武汉博士德公司;多聚赖氨酸粘片剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司;姜黄素购自美国Sigma公司。

　　1.2 动物

　　6～8周龄清洁级雄性Wistar大鼠32只,体重180～200 g,山西医科大学动物实验中心提供。

　　2 实验方法

　　2.1 造模和分组

　　随机分为4组：假手术组(8只,仅予生理盐水)、模型组(8只,仅予二甲基亚砜)、姜黄素组[8只,100 mg/(kg·d)]、依那普利组[8只,10 mg/(kg·d)]。各组大鼠均于术后第2天开始腹腔注射给药。参照文献[5]方法制作UUO肾小管间质纤维化模型。假手术组打开腹腔后分离左侧输尿管,并不结扎即关闭腹腔。术后第4周,右心耳心脏穿刺抽血约6 mL,用自动生化仪测定尿素氮(BUN)、肌肝(Cr)。之后处死各组大鼠,左侧肾脏行原位灌流去除血细胞后,部分肾组织用10%中性福尔马林液固定,其余肾放入液氮中保存备用。

　　2.2 肾组织病理学检查

　　动物麻醉后取双侧肾脏观察其大体外观变化,取部分梗阻肾经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋,切4 μm厚的切片,行HE染色及Masson染色,光学显微镜(×200)采集Masson染色图像(每只大鼠随机采集15个视野),以多功能彩色病理图像分析系统(山西医科大学)进行自动测量分析,计算肾间质纤维组织相对面积(肾间质绿染区面积/视野总面积×100%)。

　　2.3 免疫组化染色

　　采用SABC法进行免疫组化检测。切片常规处理后,用微波处理10 min(TGF-β1、α-SMA、Vimentin)修复抗原。分别滴加相应第一抗体,4 ℃冰箱孵育过夜。然后加入相应生物素化第二抗体,37 ℃,20 min,滴加链酶亲和素-生物素-过氧化物酶,37 ℃,20 min,最后加入DAB显色液,显微镜下控制显色。每次染色用PBS缓冲液代替一抗设立阴性对照。TGF-β1、α-SMA、Vimentin蛋白的阳性表达部位呈棕黄色深染。免疫组化半定量分析借助多媒体病理彩色分析系统完成。在200倍光镜下采集免疫组化图像,每张切片随机采集10个不重叠视野(避开肾小球及动脉血管),计算肾小管间质相对阳性面积(肾小管间质阳性面积/视野总面积×100%),并取平均值。

　　2.4 统计学方法

　　实验数据均以x±s表示,组间差异比较采用单因素方差分析,由SPSS11.0统计软件完成。

　　3 结果

　　3.1 血生化检测结果

　　(见表1)表1 各组大鼠血清BUN比较(略)注：与假手术组比较,*P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01(下同)。

　　3.2 肾脏病理学改变

　　3.2.1 大体观察

　　假手术组大鼠两侧肾脏外观正常,大小如黄豆。模型组、姜黄素组、依那普利组左侧肾脏大小平均约3.6 cm×1.8 cm×1.7 cm。可见肾内积水,积液清亮透明,肾实质明显变薄,厚度<1 mm,肾盂扩张,肾盏乳头受压,穹隆部乳头变平钝,部分成凹型,乳头缺血萎缩,最后锥体消失。

　　3.2.2 光镜观察

　　假手术组大鼠双侧肾脏无明显病理改变。模型组大鼠左肾术后第4周,肾小球大小、形态基本正常;肾小管结构遭到严重破坏,代之以浸润的炎性细胞弥漫于大量增生的纤维组织中,主要为巨噬细胞和淋巴细胞。残存肾小管上皮细胞水肿、变性、坏死、间质间隙增宽,肾间质纤维化明显。姜黄素组及依那普利组上述变化有所减轻,肾间质纤维组织相对面积减小。

　　3.2.3 Masson染色结果

　　(见表2) 表2 各组大鼠Masson染色结果比较(略)

　　3.3 免疫组化染色结果

　　(见表3)表3 各组大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA和Vimentin蛋白表达情况(略)

　　4 讨论

　　姜黄素是一种从姜科植物姜黄中提取的天然药物,中医认为,姜黄能行气、散风活血、通经止痛。近年研究还揭示出姜黄具有抗炎、抗氧化、保护肝脏和肾脏、抗肺纤维化、肝纤维化等作用[6]。最新研究显示,姜黄素能明显抑制UUO大鼠肾间质炎症和纤维化,其机制可能与抑制核因子-κB(NF-KappaB)的表达有关[7]。本研究结果显示：姜黄素能明显下调肾组织内α-SMA和Vimentin的表达,提示抑制肾小管上皮细胞转分化可能是其在体内发挥作用的主要机制。同时,我们也发现,姜黄素也能明显下调肾组织内TGF-β1表达。二者之间是否存在一定的关系?

　　肾小管上皮细胞转分化的发生机制目前还不十分清楚,已有的研究认为一些细胞因子可能起着重要的调节作用,其中TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的作用已得到公认。肾脏损伤使TGF-β1等多种细胞因子产生增加,一定浓度的TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞向间质肌成纤维细胞转分化,肾小管上皮细胞呈现间质细胞特性后,包括TGF-β1在内的多种细胞因子表达上调[8]。这种正反馈机制可能是肾间质纤维化持续发展的原因之一,而姜黄素可能通过打断这一恶性循环,从而抑制肾间质纤维化的发生发展。本研究结果显示：姜黄素和依那普利无论在降低BUN水平、减小肾间质纤维组织相对面积方面,还是在抑制肾组织内TGF-β1、α-SMA和Vimentin的表达方面,作用均极其相似。有关姜黄素抑制肾小管上皮细胞转分化的具体机制尚须进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Shahed AR, Jones E, Shoskes D. Quercetin and curcumin up-regulate antioxidant gene expression in rat kidney after ureteral obstruction or ischemia/reperfusion injury[J]. Transplant Proc,2001,33(6)：2988.

　　[2] 黄映红,刘晓城,黄征宇,等.姜黄素对大鼠糖尿病肾的实验研究[J].中国现代医学杂志,2004,14(7)：94-97.

　　[3] Punithavathi D,Venkatesan N, Badu M. Curcumin inhibition of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J].Br J Pharmacol, 2000,131(2)：169-172.

　　[4] Kang HC,Nan Jx,Park PH,et al.Curcumin inhibits collagen synthesis and hepatic stellate cell activation in-vivo and in-vitro[J].J Pharm Pharmaco,2002,54(1)：119-126.

　　[5] Kaneto H, Morrissey J, Klahr S. Increased expression of TGF-β1 mRNA in the obstructed kidney of rats with unilateral ureteral ligation[J].Kidney Int,1993,44(2)：313-321.

　　[6] Han SS,Keum YS,Seo HJ,et al.Curcumin suppresses activation of NF-kappa B and AP-1 induced by phorbol ester in cultured human promyelocytic leukemia cells[J].J Biochem Mol Biol,2002,35(3)：337-342.

　　[7] Kuwabara N, Tamada S, Iwai T,et al. Attenuation of renal fibrosis by curcumin in rat obstructive nephropathy[J].Urology,2006,67(2)：440-446.

　　[8] 王 玉,李晓玫,邹万忠,等.人类肾小球肾炎中肾小管及间质细胞表型转化的研究[J].中华肾脏病杂志,2000,16(1)：7-10