谷氨酰胺增强氧化应激时肺微血管内皮细胞热休克蛋白70的表达

　　【摘要】 目的 研究谷氨酰胺(Gln)对氧化应激状态下体外培养肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVEC)热休克蛋白(HSP)70表达的影响。方法 采用体外培养Wistar大鼠PMVEC，分为阳性对照组(G组)、生理盐水组(PS组)、谷氨酰胺组(Gln组)、过氧化氢加生理盐水组(H2O2+PS组)和过氧化氢加谷氨酰胺组(H2O2+Gln组)。Western blotting检测PMVEC HSP70的表达情况，分别记录平均灰度值。结果 与PS组(9.05±1.51)相比，Gln组(40.28±10.19)和H2O2+PS组(43.89±10.32)PMVEC HSP70表达分别增高4.5倍和5倍(P<0.01);与H2O2+PS组相比，H2O2+Gln组(65.59±14.53)HSP70表达进一步增高，约为PS组的7倍，接近G组(70.56±12.23)表达水平。结论 谷氨酰胺可增强氧化应激状态下体外培养肺微血管内皮细胞HSP70表达。

　　【关键词】 肺微血管内皮细胞 过氧化氢 谷氨酰胺 热休克蛋白70

　　LI Liang1， ZHANG Li1， QU Xun2， MENG Fanqing3

　　(1. Second Department of Anesthesiology; 2. Institute of Clinical Fundament Research,

　　Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China; 3. Department of Anesthesiology,

　　Jinan Maternal and Child Health Hospital, Jinan 250001, China)

　　Abstract： Objective To investigate the effects of glutamine on the expression of heat shock protein (HSP) 70 in pulmonary microvascular endothelial cells (PMVECs) under oxidative stress conditions. Methods PMVECs from Wistar rats were divided into 5 groups: the positive control group (G group), the physiologic saline group (PS group), the glutamine group(Gln group), the H2O2+PS group and the H2O2+Gln group. Western blotting was used to investigate the expression of HSP70. Results Compared with the PS group, the expression of HSP70 significantly increased in the Gln group(9.05±1.51 vs 40.28±10.19) and the H2O2+PS group(9.05±1.51 vs 43.89±10.32). The expression of HSP70 was higher in the H2O2+Gln group than in the H2O2+PS group(65.59±14.53 vs 43.89±10.32). Conclusion Glutamine enhances the expression of HSP70 in pulmonary microvascular endothelial cells under oxidative stress conditions.

　　Key words: Pulmonary microvascular endothelial cells; Hydrogen peroxide; Glutamine; HSP70 heatshock proteins 反应性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的大量产生是各种原因引起急性肺损伤的共同机制，大量的ROS可导致细胞过氧化损伤，促进肺不张并破坏肺损伤的修复。热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)具有重要的抗氧化损伤作用[1]，但因为已知HSP70的各种诱导因素本身具有毒性或机体不能耐受，所以寻找一种可临床应用的有效的HSP70诱导剂引起了许多研究者的极大兴趣。谷氨酰胺是一种“条件必需性氨基酸”，近年来发现它是一种有效的热休克蛋白诱导剂，可明显增强内毒素休克时HSP70的表达[2]。本研究拟观察谷氨酰胺对体外培养肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells ，PMVEC)处于氧化应激状态时HSP70表达的影响，以期为进一步防治高氧应激肺损伤提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠(200 250?g，购于山东大学实验动物中心)。

　　1.1.2 主要试剂 DMEM培养液(Hyclone公司，美国)，Ⅷ因子相关抗原、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，兔抗大鼠HSP70(Santacruz公司，美国)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，谷氨酰胺(Sigma公司，美国)，胰蛋白酶(北京拜尔迪生物技术有限公司)，RIPA细胞裂解液(北京普利莱基因技术有限公司)，二抗试剂盒(Kirkegaard and Perry Laboratories，美国)，预染蛋白Marker(Fermentas公司，美国)。

　　1.1.3 主要仪器 CO2培养箱(Heraeus，德国)，VS840KU超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)，低温超速离心机(Heraeus，德国)，GeneQuant pro蛋白核酸测定仪(美国biochrom)，JV92—77D超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司),等电聚焦电泳仪(BioRad公司，美国)，电泳槽及转印电泳槽(BioRad公司，美国)，捷达801专业数码凝胶成像与分析系统3.3。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肺微血管内皮细胞(PMVEC)的培养、纯化和鉴定 参考文献[3]的方法。倒置相差显微镜下，细胞呈典型的铺路石状镶嵌排列。采用Ⅷ因子相关抗原，通过SABC免疫组化法染色，DAB显色鉴定PMVEC。

　　1.2.2 实验分组 将细胞传代培养在盖玻片上，每孔接种浓度为1×106/mL，细胞生长至80%融合时更换无血清DMEM培养液培养24?h，使细胞处于一相对静止生长状态，然后细胞分为5组：① 阳性对照组(G组)：PMVEC 43?℃孵育1?h，然后37?℃、5%CO2培养箱中恢复4?h[4]，收取细胞;② 生理盐水组(PS组)：加入与H2O2等体积生理盐水培养5?h，加入与谷氨酰胺同体积生理盐水继续培养12?h，收取细胞;③ 谷氨酰胺组(Gln组)：加入与 H2O2等体积生理盐水培养5?h，加入谷氨酰胺使终浓度为8?mmol/L，继续培养12?h，收取细胞;④过氧化氢加生理盐水组(H2O2+PS组)：含200?μmol/L H2O2的DMEM培养液培养5?h，加入与谷氨酰胺同体积生理盐水继续培养12?h，收取细胞;⑤ 过氧化氢加谷氨酰胺组(H2O2+Gln组)：含200?μmol/L H2O2的DMEM培养液培养5?h，加入谷氨酰胺使终浓度为8?mmol/L，继续培养12?h，收取细胞。

　　1.2.3 免疫印记(Western blotting)法检测HSP70的表达 倒掉培养液，以冰预冷PBS洗涤两次，加入200?μL RIPA细胞裂解液，细胞刮收集细胞，超声粉碎，4?℃、13?000?r/min离心20?min，离心半径为9.35?cm，-80?℃保存。等量的蛋白样本进行7.5%SDS双丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后采用电转膜法将胶中蛋白转移至硝酸纤维素膜，3%脱脂奶粉封闭1?h，一抗4?℃孵育过夜，TBST冲洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2?h，加入TMB底物显色。结果使用捷达801专业数码凝胶成像与分析系统3.3分析，记录平均灰度值，实验重复4次。

　　1.3 统计学处理 数据以±s表示，各组数据比较采用t检验。所有资料采用SAS for Windows 8.1统计软件处理，P<0.01为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　如图1所示，与PS组相比，阳性对照组G组PMVEC HSP70表达明显增高，其平均灰度值为70.56±12.23，约为PS组(9.05±1.51)的7.8倍，差异有统计学意义(P<0.01);与PS组相比，Gln组和H2O2+PS组PMVEC HSP70表达增高，其平均灰度值分别为40.28±10.19和43.89±10.32，分别约为PS组的4.5倍和5倍，差异有统计学意义(P<0.01);与H2O2+PS组相比，H2O2+Gln组HSP70表达进一步增高，其平均灰度值为65.59±14.53，约为PS组的7倍，接近G组(70.56±12.23)表达水平，差异有统计学意义(P<0.01)。图1 Western blotting显示不同处理后PMVEC HSP70的表达(TMB显色)

　　3 讨 论

　　热休克蛋白70(HSP70)被认为是热休克蛋白家族中与细胞保护关系最密切的一族，它能抑制炎症反应，保护蛋白不受损伤，并且能抑制细胞的凋亡。研究发现HSP70对细胞凋亡的死亡受体通路和线粒体通路均有抑制作用[5]：① 在ROS(reactive oxygen species)参与下，抑制Fas介导的死亡受体途径;② 抑制cJun氨基末端激酶/应激激活蛋白激酶(JNK/SAPK)活性;③ 通过多个信号传导通路抑制caspase酶途径。近来，研究发现敲除HSF1基因将增加高氧导致细胞损伤的敏感性[6]，热休克因子1(Heat shock factor1, HSF1)是调节HSP表达的特定调节元件，这说明HSP有抗氧化损伤的作用，因此，增加HSP的表达可抑制细胞的氧化损伤。

　　条件必需性氨基酸谷氨酰胺(Glutamine, Gln)是一种极有潜力的热休克蛋白诱导剂，可使热应激、内毒素血症或缺血再灌注[7]等应激状态下的细胞或组织HSP70表达增高,发挥其对应激状态下的细胞或组织的保护作用。本研究发现体外培养大鼠PMVEC经过8?mmol/L谷氨酰胺培养12?h后，其HSP70表达明显增高，说明单纯谷氨酰胺即可以增加PMVEC HSP70的表达。谷氨酰胺诱导HSP70表达增高的机制尚未完全清楚，可能的机制包括：① 加强HSF1的DNA与启动子的结合活性[8]，HSP70 mRNA水平增加;② HSP70 mRNA稳定性增强，翻译增加;③ 降低HSP蛋白的降解;④ 谷氨酰胺受体影响HSP70表达等。因为谷氨酰胺无任何毒副作用，可安全应用于临床，通过对其作用机制的不断研究，对危重情况治疗将发挥更大潜力。

　　肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVEC)是构成血气屏障的重要结构，在各种原因引起的急性肺损伤病理生理过程中，PMVEC通透性增加是发病的中心环节，因此，保护PMVEC功能，对防治急性肺损伤有重要意义。本研究通过体外培养大鼠PMVEC，发现在作为ROS代表的过氧化氢(H2O2)刺激后，HSP70表达增加，这可能是氧化损伤的同时机体启动了自我保护机制以抵御损伤加强修复的表现。在过氧化氢氧化刺激后再加入谷氨酰胺，使氧化应激状态下的PMVEC表达HSP70进一步升高，以增强细胞抗损伤的能力，这是否说明谷氨酰胺可用于治疗高氧肺损伤、促进损伤修复将有待深入研究。

　　【参考文献】

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　　[3] 肖贞良，孙耕耘，钱桂生.肺循环灌注对大鼠肺微血管内皮细胞分离和培养的影响[J]. 中国病理生理杂志，1999，15(11)：10531054.

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　　[5] 李征宇,赵霞.热休克蛋白对细胞凋亡信号转导途径的调节[J].中国科学C辑生命科学,2004,34(1):613.

　　[6] Malhotra V, Kooy N W, Denenberg A G, et al. Ablation of the heat shock fator1 increases susceptibility to hyperoxiamediated cellular injury[J]. Exp lung Res, 2002, 28(8):609622.

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