谷氨酰胺抑制过氧化氢诱导的A549细胞凋亡

　　【摘要】 目的 观察谷氨酰胺诱导A549细胞表达HSP70及在抗过氧化氢(H2O2)诱导的细胞凋亡中的作用。方法 体外培养A549细胞，随机分为4组：①空白对照组(C组)即生理盐水组;②谷氨酰胺组(Gln组)：以含谷氨酰胺8?mmol/L的培养液预处理细胞;③过氧化氢组(H2O2组)：以浓度为400?μmol/L过氧化氢处理细胞;④谷氨酰胺预处理后过氧化氢刺激组(Gln+H2O2组)：以含谷氨酰胺8?mmol/L预处理细胞后，再加入400?μmol/L过氧化氢处理细胞. 用免疫印记(Western blotting)法检测HSP70蛋白的表达，记录平均灰度值;用流式细胞仪AnnexinV法检测细胞凋亡,计算细胞总凋亡率。结果 ① 与C组HSP70表达(1.87±0.55) 相比，Gln组(8.42±1.38)、H2O2组(9.35±1.57)和Gln+H2O2组(13.12±1.85)的HSP70表达分别增高约4.5倍、5倍和7倍(P<0.01);与H2O2组HSP70表达相比，Gln+H2O2组进一步增高(P<0.01);②与C组相比，Gln组细胞总凋亡率无明显变化;H2O2组和Gln+H2O2组细胞总凋亡率分别为7.48%和6.06%，均明显高于C组(P<0.01);与H2O2组相比，Gln+H2O2组细胞总凋亡率明显降低(P<0.01)。结论 谷氨酰胺诱导A549细胞表达HSP70并可明显地抑制H2O2所致的细胞凋亡作用。

　　【关键词】 谷氨酰胺 A549细胞 热休克蛋白70 过氧化氢 细胞凋亡

　　ZHANG Li1,2，　LI Liang2，　LI Kezhong3,　YAO Shanglong1

　　(Department of Anesthesiology, 1. Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of

　　Science and Technology, Wuhan 430022, China;

　　2. Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China;

　　3. Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, China)

　　Abstract： Objective To explore the effects of heat shock protein 70 induced by glutamine on the apoptosis of cultured A549 cells induced by hydrogen peroxide (H2O2). Methods Cultured A549 cells were divided into four groups: the physiologic saline group (C group), the glutamine group (Gln group), the H2O2 group and the Gln+H2O2 group. Western blotting was used to determine the expression of HSP70. Flow cytometry and AnnexinV were used to determine the apoptosis. Results ① Compared with the expression of HSP70 in the C group(1.87±0.55), the expression of HSP70 increased 4.5 times, 5 times and 7 times in the Gln group(8.42±1.38), the H2O2 group(9.35±1.57)and the Gln+H2O2 group(13.12±1.85), respectively. Also the expression of HSP70 in the H2O2+Gln group was higher than that in the H2O2 group(P<0.01). ② Compared with the C group,　the apoptosis of cells in the Gln group had not changed(P>0.05), while the apoptosis of cells in the H2O2 and the Gln+H2O2 groups significantly increased(P<0.01).Compared with the H2O2 group, the apoptosis of cells in the Gln+H2O2 group significantly decreased(P<0.01). Conclusions Glutamine can enhance the expression of HSP70 in A549 cells and inhibit the apoptosis induced by hydrogen peroxide.

　　Key words: Glutamine; A549 cell; Heatshock proteins 70; Hydrogen peroxide; Apoptosis 临床常用吸入高浓度氧(高氧)来治疗呼吸衰竭和缺氧性疾病，高氧引起肺部炎性损伤已是不争的事实[1]，如何减轻或治疗高氧引起的肺损伤已成为人们关注的热点。谷氨酰胺(Gln)在临床和动物实验中都证明对炎症性损伤有保护作用，虽然其保护机制不完全清楚，但实验和临床结论表明，谷氨酰胺的器官保护作用与其明显提高热休克蛋白70(HSP70)表达有关[23]。HSP70是细胞在炎症、热休克、过氧化物、肿瘤坏死因子等应激因素的作用下大量表达的蛋白质，具有明显的细胞保护作用。本研究通过Gln诱导A549细胞表达HSP70，观察高表达HSP70的A549细胞对过氧化氢(H2O2)所致细胞凋亡的抑制作用，为临床防治高氧肺损伤提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 细胞 标准永生化肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549购于山东省医学科学院。

　　1.1.2 主要试剂 含2?mmol/L谷氨酰胺DMEM培养液、不含谷氨酰胺DMEM培养液(Hyclone)，谷氨酰胺(Sigma)，胎牛血清(杭州四季青)，胰蛋白酶(北京拜尔迪)，AnnexinV凋亡测定试剂盒(晶美生物)，RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京普利来)，兔抗人HSP70(Cell Signaling)，二抗试剂盒(KPL)，预染蛋白Marker(Fermentas)。

　　1.1.3 主要仪器 CO2培养箱(Heraeus)，超净工作台(安泰VS840KU)，倒置相差显微镜(Olympus)，流式细胞仪(BD FACSCalibur)，蛋白核酸测定仪(GeneQuant pro)，超声波细胞破碎仪(JV92-77D)，等电聚焦电泳仪(BioRad)，电泳槽及转印电泳槽(BioRad)，捷达801专业数码凝胶成像与分析系统3.3。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养 人肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549常规培养：细胞在含10%胎牛血清DMEM培养液中，于37?℃，5%CO2恒温恒湿培养箱中培养，待细胞生长至约85%融合状态用0.25%胰蛋白酶消化进行传代。

　　1.2.2 实验分组 细胞生长至铺满80%瓶底时更换无血清培养液培养过夜，使细胞处于一相对静止生长状态，然后细胞分为4组。①空白组(C组)：不含谷氨酰胺DMEM培养液洗1遍，PBS洗2遍，以不含谷氨酰胺的DMEM培养液培养细胞12?h后，与过氧化氢同体积生理盐水加入培养液继续培养5?h，收取细胞;②谷氨酰胺组(Gln组)：细胞生长至铺满80%瓶底时处理同上，以含谷氨酰胺8?mmol/L的DMEM培养液预处理细胞12?h后，与过氧化氢同体积生理盐水加入培养液继续培养5?h，收取细胞;③过氧化氢组(H2O2组)：细胞生长至铺满80%瓶底时处理同上，以不含谷氨酰胺的DMEM培养液预处理细胞12?h后，过氧化氢400?μmol/L刺激5?h，收取细胞;④谷氨酰胺预处理后过氧化氢刺激组(Gln+H2O2组)：细胞生长至铺满80%瓶底时处理同上，以含谷氨酰胺8?mmol/L的DMEM培养液培养细胞12?h后，过氧化氢400?μmol/L刺激5?h，收取细胞。

　　1.2.3 免疫印记(Western blotting)法检测HSP70蛋白的表达 倒掉培养液，以冰预冷PBS洗涤2次，加入200?μL RIPA细胞裂解液，细胞刮收集细胞，超声粉碎，4?℃、13?000?r/min离心20?min，离心半径为9.35?cm，-80?℃保存。等量的蛋白样本进行7.5%SDS双丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后采用电转膜法将胶中蛋白转移至硝酸纤维素膜，3%BSA封闭1?h，一抗4?℃孵育过夜，TBST冲洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2?h，加入TMB底物显色。结果使用捷达801专业数码凝胶成像与分析系统3.3分析，记录平均灰度值，实验重复4次。

　　1.2.4 流式细胞仪AnnexinV法检测细胞凋亡 各组收取的细胞，用4?℃预冷的PBS洗涤2次，尽量轻柔操作，减轻对细胞的损伤。用250?μL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106/mL;取100?μL的细胞悬液于5?mL流式管中，加入5?μL AnnexinV/FITC和10?μL 20?μg/mL的碘化丙锭溶液;混匀后于室温避光孵育15?min;在反应管中加400?μL PBS，流式细胞仪分析，实验重复4次。

　　1.3 统计学处理 数据以±s表示，所有资料采用SAS for Windows 8.1统计软件处理，各组之间的数据比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同处理组对A549细胞HSP70蛋白表达的影响 与C组HSP70蛋白表达灰度值(1.87±0.55)相比，Gln组(8.42±1.38)、H2O2组(9.35±1.57)及Gln+H2O2组(13.12±1.85)的HSP70蛋白表达分别增高了约4.5倍、5倍和7倍(P<0.01);与H2O2组相比，Gln+H2O2组(13.12±1.85)HSP70蛋白表达进一步增高(P<0.01)。见图1，其平均灰度值见表1。

　　*2.2 不同处理组对H2O2诱导的A549细胞凋亡的影响 与C组相比，Gln组细胞总凋亡率无明显变化(P>0.05);与C组相比，H2O2组和Gln+H2O2组细胞总凋亡率明显增高(P<0.01);与H2O2组细胞相比，Gln+H2O2组细胞总凋亡率明显降低(P<0.01);见表2和图2。

　　3 讨 论

　　高浓度氧能直接损伤肺或使原有肺部疾病恶化,高氧引起的细胞损伤很重要的原因是大量氧自由基的产生, 过氧化氢(H2O2)是氧自由基的主要成份之一。自由基可通过几种机制引起细胞损伤:包括损伤线粒体和耗竭ATP,使细胞膜脂质和细胞内蛋白质氧化,引起DNA损伤等。 高氧引起的肺损伤以肺水肿和肺部炎症改变为特征,组织学改变包括中性粒细胞、肺巨噬细胞的聚集活化，肺上皮细胞和内皮细胞广泛凋亡和坏死，毛细血管通透性增加，肺间质与肺泡水肿[4]。因此，如何减轻或防治高氧肺损伤成为当前关注的热点。

　　谷氨酰胺(Gln)是一种无毒副作用的非必须氨基酸，能增强细胞在各种应急情况下的存活能力,对很多危重患者和损伤性疾病有益，可明显地改善其预后。Singleton等证明Gln对脓毒血症引起的肺损伤具有明显的保护作用，可明显地降低小鼠的死亡率，并且证明Gln的保护作用是通过促进热休克转录因子(HSF1)的磷酸化和增加HSP的表达，Ziegler等证明Gln用于危重患者可增加血清中HSP70的含量，缩短了患者在ICU的住院时间。Ogunlesi 等[5]证明谷氨酰胺可提高A549细胞在高氧环境下生长和生存能力。众多学者认为，Gln减轻细胞、组织器官的损伤机制是通过增加细胞HSP70的表达，并且证明Gln是一种安全的可用于临床的HSP诱导剂[69]。

　　热休克蛋白(HSPs)是生物体细胞在一系列应激因素作用下产生的具有高度保守性的一组细胞保护性蛋白质，具有重要的分子伴侣功能，能帮助蛋白质折叠及移位，防止蛋白质聚集，帮助变性蛋白质解聚及复性，促进严重受损蛋白质的降解等。其中HSP70家族与细胞保护之间的关系最密切，它能抑制炎症反应，保护蛋白不受损伤，防止细胞破坏，抑制细胞凋亡[1011]。敲除热休克转录因子(HSF1)的细胞更易受氧化损伤[12]。采用各种因素诱导HSP表达增加后可抑制细胞凋亡的发生[13]。因此,热休克蛋白对组织、细胞保护作用及其机制的研究将成为热点。

　　A549细胞是具有肺Ⅱ型上皮细胞特性的人肺腺癌细胞，可用于代替肺Ⅱ型上皮细胞进行实验研究，肺Ⅱ型上皮细胞既是氧化损伤的主要靶标，又是肺上皮细胞增生修复的干细胞，保护肺Ⅱ型上皮细胞功能在肺损伤修复中意义尤为重要。Wong等[14]通过转染技术增加HSP70表达可使肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549细胞抵御高氧损伤，明显提高氧化应激时细胞的存活能力，本研究利用谷氨酰胺这一安全、无毒副作用的、可用于临床的治疗药物成功地诱导A549细胞表达HSP70，对其临床治疗高氧肺损伤提供了实验依据。谷氨酰胺上调HSP70表达的机制尚未完全清楚，可能的机制包括：①加强热休克因子1的DNA与启动子的结合活性[15], HSP70 mRNA水平增加;②增强HSP70 mRNA稳定性，翻译增加;③降低HSP70蛋白的降解;④谷氨酰胺受体影响HSP70表达等。本研究同时证明了高表达HSP70的A549细胞可明显地抑制由H2O2所致的细胞凋亡作用。现已知的HSP70抑制细胞凋亡作用机制有：①在反应性氧自由基参与下，抑制Fas介导的死亡受体途径;②抑制JNK/SAPK活性;③通过多个信号转导通路抑制caspase途径，提示HSP70不但保护细胞蛋白不受损伤，而且通过多条途径或在同一途径中作用于不同水平起到抑制细胞凋亡的作用，增强细胞、组织抗损伤能力。

　　综上所述，谷氨酰胺可明显地上调体外培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞HSP70蛋白表达，并明显地抑制H2O2所致的细胞凋亡。

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