柞蚕雄蛾提取液改善W256荷瘤大鼠放疗后免疫功能的实验研究

　　【摘要】 观察柞蚕雄蛾提取液对荷W256癌肉瘤大鼠放疗后免疫功能的影响。方法 60只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、单纯放疗组和实验组(放疗与柞蚕蛾提取液联合治疗组)，每组15只。建立W256荷瘤大鼠模型，分离脾脏和胸腺，并计算脏器指数;采用流式细胞术(FCM)及酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测外周血T淋巴细胞亚群变化和血清中细胞因子INFγ和IL4含量。结果 与放疗组相比较，柞蚕雄蛾提取液可以升高放疗后荷瘤大鼠脾脏和胸腺指数，增加放疗后荷瘤大鼠外周血中CD4+T细胞比例与CD4+T/CD8+T值(P<0.05);实验组荷瘤大鼠血清中细胞因子INFγ含量明显升高，而IL4含量显著降低(P<0.05)。结论 柞蚕雄蛾提取液可以逆转荷瘤大鼠放疗后免疫功能抑制状态，改变荷瘤机体免疫功能，可作为恶性肿瘤传统放疗中的辅助用药。

　　【关键词】 柞蚕 Th1/Th2漂移 T淋巴细胞亚群 大鼠 Wistar

　　ZHANG Weidong1，　ZHANG Yueying1，　WANG Zhaoxia1，　JIA Qing1，　WANG Zhaopeng1，　YU Jinming2

　　(1. Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Science, Key Laboratory for

　　Modern Medicine and Technology of Shandong Province, Jinan 250062, China;

　　2. Shandong Provincial Tumor Hospital, Jinan 250117, China)

　　Abstract: Objective To study the effects of an extract from the male zooid on reversing the radiationinduced immunosuppression of rats bearing W256 carcinoma. Methods Tumor models were established by subcutaneously injecting W256 tumor cells into rats. 60 Wistar rats were randomly divided into 4 groups. The thymus index and the spleen index were used as parameters to evaluate the effect of an extract from the male zooid on nonspecific and specific immune function of rats with tumor. The presence of Interferon gamma (INFγ) and interleukin4 (IL4) in the peripheral blood serum were screened by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) to investigate cellmediated immune responses and T subsets were determined by flow cytometry(FCM). Results The extract from the male zooid significantly raised the thymus index and the spleen index of rats with tumors. The number of CD4+T and the CD4+T/CD8+T ratio of W256bearing rats treated with the extract from the male zooid significantly increased compared with the radiotherapy group (P<0.05). Also, the level of Interferongamma (INFγ) was upregulated and interleukin 4(IL4) was downregulated. Conclusions The extract from the male zooid of Antheraea pernyi has effect of reversing the radiationinduced immunosuppression and could be regarded as a main assistant agent combined with traditional radiotherapy for treatment of malignant tumors.

　　Key words： Antheraea pernyi; Th1/Th2 shift; Tlymphocyte Subsets; Rat， Wistar 放射疗法是治疗恶性肿瘤的重要手段之一,具有直接的即时疗效，但是伴随着放疗也出现副作用，尤其是放疗后荷瘤机体的免疫功能进一步降低，导致治疗失败[1]。因此，调节放疗后荷瘤机体免疫功能状态是该领域亟待解决的问题。本课题组前期研究发现，柞蚕雄蛾浓缩液对正常小鼠细胞免疫功能和体液免疫功能具有一定增强作用[2]，而且可以逆转大鼠放射性免疫损伤作用[3]。本实验以Wistar大鼠荷瓦克氏肉瘤256(W256)模型为研究对象，对荷瘤大鼠进行常规放射治疗后给予柞蚕雄蛾提取液灌胃处理，旨在进一步研究柞蚕雄蛾提取液对放疗后荷瘤大鼠免疫功能的影响，为其开发利用提供一定的实验理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1 实验动物 Wistar大鼠60只，雄性，体重(180±20)g，购自山东大学实验动物中心，批号：SCXK(鲁)20030004;W256腹水瘤种购自中国医学科学院药物研究所药理室。

　　1.1.2 实验仪器与试剂 柞蚕雄蛾提取液由山东省蚕业研究所提供;ELISA检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司;CD4/CD8FITC荧光抗体购自美国Santa Cruz公司;SWCJIC标准型双人净化工作台由苏州净化设备厂生产;西门子PRIMUS医用电子直线加速器系德国西门子公司生产;CoulTer Epicsxl-4流式细胞仪系美国BD公司生产;Specltramax M2全自动酶标仪系美国MD公司生产。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Walker256细胞悬液的制备 从腹水型Walker256瘤株大鼠腹腔中抽取传代7 9?d的白色腹水，用生理盐水稀释成4×107/mL细胞悬液备用。

　　1.2.2 动物分组及处理 60只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、单纯放疗组和实验组(放疗与柞蚕蛾提取液联合治疗组)，每组15只。

　　荷瘤模型的制备：于大鼠右侧腋部皮下接种Walker256细胞，0.2?mL/只，5?d成瘤。单纯放疗组和实验组给予常规放疗照射，剂量率100?cGy/min，源皮距205?cm，5?Gy/d，连续照射2?d，共10?Gy。实验组于照射后给予柞蚕雄蛾提取液(16.53?mg/kg)灌胃，每天1次，每次2?mL,连续7?d。其它各组给予同等量生理盐水灌胃。于末次给药24?h后抽取外周血检测细胞因子及T淋巴细胞亚群;处死动物，剥离胸腺和脾脏，称重并计算脏器指数。胸腺(或脾脏)指数=胸腺(或脾脏)重量(mg)/体重(g)。

　　1.2.3 流式细胞术(FCM)检测外周血T淋巴细胞亚群 肝素抗凝大鼠外周血2?mL，采用密度梯度离心法分离淋巴细胞。调至细胞浓度约1×106/mL，按流式细胞仪常规要求检测T淋巴细胞亚群。

　　1.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清细胞因子水平 采用ELISA双抗夹心法检测各组大鼠血清中IFNγ和IL4含量。严格按照ELISA试剂盒说明书操作步骤进行，待显色终止后即刻测量OD450值，绘制标准曲线，计算样品浓度。

　　1.3 统计学处理 数据以±s表示，采用SPSS11.0软件进行统计学分析。

　　2 结 果

　　2.1 柞蚕雄蛾提取液对荷瘤大鼠胸腺、脾脏的保护作用 见表1。由表1可见，模型组荷瘤大鼠脾脏指数和胸腺指数明显低于对照组，放疗组则进一步降低。放疗组与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.05);放疗后给予柞蚕雄蛾提取液灌胃的实验组荷瘤大鼠脾脏指数和胸腺指数均较单纯放疗组升高(P<0.05)。

　　脾脏指数(mg/g)胸腺指数(mg/g)对照组2.46±0.231.38±0.13模型组1.93±0.15#1.23±0.09放疗组1.58±0.17△1.06±0.11△实验组2.37±0.13*1.21±0.15*2.2 柞蚕雄蛾提取液对荷瘤大鼠放疗后T细胞亚群的影响 见表2。由表2可见，与对照组比较，模型组荷瘤大鼠外周血中CD4+T所占百分比明显降低(P<0.05);放射治疗后进一步降低，与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05);与放疗组比较，实验组荷瘤大鼠外周血CD4+T细胞百分比增加，CD4+T/CD8+T值升高(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　放射治疗在抑制或杀伤肿瘤细胞的同时，对机体正常细胞也有严重的损害作用，而且还可能使免疫功能进一步降低导致治疗失败，所以在放化疗时要特别注意纠正机体免疫功能抑制状态。祖国医学在肿瘤的辅助治疗中具有独特的优势，治疗以扶正为主，配合活血化淤、解毒散结的方法，以增强机体抵抗力，控制肿瘤复发转移。

　　雄蚕蛾属药食同源昆虫，含有多种人体必需氨基酸和微量元素，其可食性和保健治疗作用早已被民间经验所证实[4]。蚕蛾作为中药最早始载于《名医别录》，谓之“原蚕"。现代药理研究表明，原蚕蛾资源可用于肿瘤的扶正治疗。在机体抗肿瘤免疫中细胞免疫是关键，但绝大多数肿瘤患者的T细胞各个亚群的绝对值明显降低，并且T细胞亚群比例失调和功能异常,因此，检测T淋巴细胞亚群是目前观察细胞免疫水平的重要方法之一。外周血T细胞亚群在数量功能上的协调，特别是CD4+T/CD8+T值是反应机体免疫状态的重要指标。本研究结果表明，模型组荷瘤大鼠外周血CD4+T和CD8+T细胞总数明显低于正常对照组，CD4+T/CD8+T值也明显降低，表明荷瘤机体存在细胞免疫功能低下，机体处于免疫功能抑制状态;放疗组荷瘤大鼠行放射治疗后，CD4+T/CD8+T比例失调进一步加重，表明放疗后荷瘤大鼠T细胞免疫功能下降;实验组与单纯放疗组比较，CD4+T百分含量明显增加，CD4+T/CD8+T值明显升高(P<0.05)，表明柞蚕雄蛾提取液对荷瘤机体放疗后免疫功能抑制有逆转作用。

　　正常机体的CD4+T细胞，可分泌Th1/Th2两类细胞因子，Th1型细胞因子以IFNγ为代表，介导细胞免疫应答，与机体抗肿瘤抗病毒作用有关;Th2型细胞因子以IL4为代表，介导体液免疫应答，与移植物耐受、抑制自身免疫疾病有关。正常机体的Th1/Th2型细胞因子处于动态平衡，在疾病状态下Th1/Th2动态平衡被打破，出现Th1/Th2漂移。某些肿瘤细胞亦可分泌Th2类细胞因子[5]，Th1/Th2漂移偏向于Th2优势与恶性肿瘤病程进展有关[6]。Yamazaki等[7]认为，检测荷瘤机体血清中的INFγ与 IL4水平可以很好地评价T细胞的抗肿瘤免疫效应。本研究采用ELISA检测荷瘤大鼠血清中Th1型细胞因子IFNγ和Th2型细胞因子IL4表达水平，结果表明，模型组荷瘤大鼠血清中IFNγ含量显著降低而IL4升高，出现Th2优势状态。单纯放疗组中IFNγ水平较前者进一步降低，IL4水平升高，提示应用传统放射治疗虽然可以起到杀伤肿瘤细胞的作用，但可能进一步加重荷瘤机体免疫抑制状态;与单纯放疗组比较，实验组荷瘤大鼠血清中IFNγ含量明显增高，IL4水平明显降低(P<0.05)，表明柞蚕雄蛾提取液可以逆转Th1/Th2漂移，增强荷瘤机体细胞免疫功能。

　　综上所述，柞蚕雄蛾提取液不但可以增加荷瘤大鼠放疗后脾脏和胸腺指数，增强机体非特异性抗肿瘤免疫功能，而且可以逆转荷瘤大鼠放疗后Th1/Th2漂移状态，改善荷瘤机体免疫功能抑制状态，增强抗肿瘤细胞免疫功能，因此，有望从中开发出具有扶正作用的抗肿瘤辅助新药。

　　【参考文献】

　　[1] 蔡勇，张雪梅，杨静贤，等.放射治疗对肿瘤患者细胞免疫功能的影响[J].北京医科大学学报，1999，31(4)：封三.

　　[2] 张维东，董强，贾青，等.柞蚕雄蛾浓缩液影响小鼠免疫功能的实验研究[J].肿瘤防治杂志，2004，11(8)：799802.

　　[3] 张维东，黄山英，贾青，等.柞蚕雄蛾提取液逆转大鼠放射性免疫抑制的作机制研究[J].国际肿瘤学杂志，2006，33(8)：634636.

　　[4] 邹德庆，郑淑湘，李全宏，等.柞蚕雄蛾浓缩液成分及其调节免疫功能的研究[J].食品科学，2006，27(5)：231234.

　　[5] Agarwal A， Rani M， Sala GK， et al. Disregulation expression of the Th2 cytokines gene in patients with intraoral squamous cell carcinoma[J]. Immunol Invest， 2003， 32(12)：1730.

　　[6] Lauerova L， Dusek L， Simickova M， et al. Malignant melanoma associates with Th1/Th2 imbalance that coincides with diseases progression and immunotherapy response[J]. Neoplasma， 2002， 49 (3)：159166.

　　[7] Yamazaki K， Yano T， Kameyama T， et al. Clinical significance of serum TH1/TH2 cytokines in patients with pulmonary adenocarcinoma[J]. Surgery， 2002， 131(Suppl 1)：S236241.