慢性低氧钙激活氯通道在大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

　　【摘要】 目的 探讨慢性低氧时钙激活氯通道(ClCa)在大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖中的作用。方法 将PASMCs分别置于常氧及慢性低氧下，采用形态学、流式细胞术、免疫细胞化学法，观察ClCa阻滞剂尼氟灭酸(NFA)和indaryloxyacetic acid (IAA-94)对PASMCs增殖的影响。结果 慢性低氧：① PASMCs呈合成表型，而常氧为收缩表型，NFA和IAA-94干预后呈合成表型的PASMCs向收缩型转变;② S+G2M 期细胞所占比例增高，NFA和IAA-94干预后减低，且G0G1期细胞所占比例增加 (P<0.01);③ PCNA 表达阳性率增高，NFA和IAA-94干预后降低 (P<0.01);④ c-fos和c-jun蛋白阳性染色A增高，NFA和IAA-94干预后降低 (P<0.01)。结论 慢性低氧引起细胞表型改变，可促进细胞增殖，而抑制ClCa的活性可抑制细胞的增殖，提示ClCa参与了低氧PASMCs的增殖。

　　【关键词】 肺动脉平滑肌细胞;钙激活氯通道; 尼氟灭酸;细胞增殖

　　Effect of calcium-activated chloride channels on proliferation of pulmonary artery smooth

　　muscle cells in rats under chronic hypoxic condition

　　YANG Zhao, et al.(Ningxia People's Hospital, Yinchuan 750021, China)

　　[Abstract] Objective To investigate the effect of calcium-activated chloride (ClCa) channels on proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) in rats under chronic hypoxic condition. Methods The cultured PASMCs were under normoxic and chronic hypoxic conditions: The cells were observed by light and electron microscope; The cell cycles were observed by flow-cytometry; Immunocytochemistry staining was used to detect the expressions of PCNA, c-fos and c-jun of PASMCs. Results The PASMCs were contractile phenotype under normoxic condition and were synthetic phenotype under chronic hypoxic condition. After NFA and IAA-94, the situations were reversal; The number of S+G2M PASMCs were significantly increased in chronic hypoxic condition; The NFA and IAA-94 were significantly decreased after intervention and the number of G0G1 PASMCs were significantly increased (P<0.01); In chronic hypoxic condition, the expression of proliferating cell nucleus antigen was significantly increased; The NFA and IAA-94 were significantly decreased (P<0.01); The expression A of c-fos and c-jun were significantly increased in chronic hypoxic condition; The NFA and IAA-94 were respectively significantly decreased (P<0.01). Conclusion Hypoxic initiated the changes of PASMCs from contractile to synthetic phenotype could increase proliferation of PASMCs. NFA and IAA-94 could depress cell proliferation by blocking ClCa channels in hypoxic condition. These may play an important role in proliferation of PASMCs under chronic hypoxic condition.

　　[Key words] Pulmonary artery smooth muscle cells; Ca2+-activated Cl- channels; Niflumic acid; Cell proliferation

　　低氧肺动脉高压(HPH)的形成是慢性肺原性心脏病发生和进展的中心环节，肺血管结构重建在HPH形成中起关键作用，而肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的增殖又是低氧肺动脉壁构型重建的一个重要环节[1]。低氧可以引起细胞质内游离钙离子浓度([Ca2+]i)升高，进而促进PASMCs增殖[2]，而[Ca2+]i升高又是激活PASMCs钙激活氯通道(Ca2+-activated Cl-，ClCa)的必要条件[3]。本研究利用光镜和电镜观察慢性低氧对大鼠PASMCs形态的影响，流式细胞术观察细胞周期，免疫细胞化学技术检测增殖细胞核抗原(PCNA)及基因c-fos和c-jun的蛋白表达，观察ClCa阻滞剂尼氟灭酸(NFA)和indaryloxyacetic acid (IAA-94)对培养大鼠PASMCs增殖的影响，为阐明ClCa在HPH发生发展中的作用提供基础资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 溶液和试剂：健康雄性成年SD大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物部提供)20只，体重200-250 g，自由进食饮水。二硫苏糖醇(DTT)和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(4-2-hydroxyethyl-1-piperazine-ethanesulfonicacid, HEPES) 购自美国Roche公司。胎牛血清和DMEM购于美国Gibco公司。I型胶原酶、Triton X-100、NFA，IAA-94、二甲基亚砜(DMSO)，均购于美国Sigma公司，其余试剂为国产分析纯。大鼠单克隆抗体α肌动蛋白(α-actin)、单克隆抗体-增殖细胞核抗原(PCNA)、抗c-fos抗体和抗c-jun抗体、链霉卵白素过氧化酶(SP)免疫组织化学试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)，均购于美国Santa Cruz 生物技术公司。

　　1.2 大鼠PASMCs分离、培养、鉴定和分组：参照孔炜等[4]的方法培养PASMCs，经平滑肌α-actin单克隆抗体免疫细胞化学染色鉴定为平滑肌细胞。实验分组：用无血清培养基(SFM)同步化24 h后，将细胞分别于常氧(37℃，5%CO2，21%O2，74%N2)及低氧(37℃，5%CO2，2%O2，93%N2)培养箱(Galaxy R CO2 Incubator，英国制造)中，采用随机排列表法将细胞分组培养48 h(电镜观察每组设3个样本，余每组均设6个样本)：①对照组(N：常氧，H：低氧，Nc, Hc)，在SFM培养;②NFA组(NNFA，HNFA) ，在含10μmol/L NFA的SFM培养;③IAA-94组(NIAA-94,HIAA-94)，在含10μmol/L IAA-94的SFM培养。

　　1.3 大鼠PASMCs形态观察：上述处理后的细胞光镜和透射电镜(OPTONEM 10C型，德国)观察其形态。

　　1.4 流式细胞术观察大鼠PASMCs周期：分别收集上述各组细胞用磷酸盐缓冲液洗涤、70%乙醇固定，4℃过夜，再收集细胞经处理后应用FACSort 流式细胞仪(美国BD公司)上机进行DNA含量及细胞周期检测。

　　1.5 免疫细胞化学染色：收集各组PASMCs的盖玻片，经清洗、固定后采用链霉亲和素-过氧化物酶(SP)法进行PCNA免疫细胞化学染色，其工作滴度为1∶200。各组均设阴性对照，省略一抗以PBS代替。PCNA的阳性染色呈棕黄色细颗粒状，主要位于细胞核。在光镜下每张玻片随机连续观察200个细胞，计数阳性百分率。

　　c-fos 和c-jun的免疫细胞化学染色与PCNA相似，将一抗换成抗c-fos抗体和抗c-jun抗体。结果经HMIAS-2000型高清晰度彩色医学图文分析系统进行图像分析，测定细胞阳性着色的积分光密度值 (AIOD值)，表示免疫细胞蛋白阳性表达的相对量。

　　1.6 统计学方法：用SPSS 12.0软件包处理数据，计量资料均以±s表示，成组资料比较用t检验，多组资料比较采用F检验，组间两两比较采用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 ClCa阻滞剂对低氧PASMCs形态的影响：常氧与慢性低氧条件下PASMCs形态差异有统计学意义，光镜下见常氧时生长的PASMCs为收缩表型，细胞长梭形，可重叠生长达多层，部分区域较稀疏，呈典型的“峰-谷”长势，透射电镜下可见细胞胞质内含丰富的肌丝束，而细胞器较疏少。慢性低氧时生长的PASMCs呈合成表型，细胞体积肥大，较均匀地分布，“峰-谷”现象不明显，电镜下见胞质中游离核糖体增多，粗面内质网腔扩张等细胞器增多(图1、2，封二)。NFA和IAA-94干预后光镜下细胞又呈现“峰-谷”长势，电镜下细胞器减少而肌丝束增多。

　　2.2 ClCa阻滞剂对PASMCs生长周期的影响：①常氧时NFA和IAA-94对PASMCs生长周期无影响。②慢性低氧时S+G2M 期细胞所占比例明显增加，NFA和IAA-94干预后S+G2M 期细胞所占比例明显减少，G0G1期细胞所占比例明显增加(P<0.01)，见表1。表1 ClCa阻滞剂对常氧和慢性低氧PASMCs细胞周期及PCNA表达阳性率的影响 注：*与Nc组比较,P<0.01, #与Hc组比较，P<0. 01

　　2.3 ClCa阻滞剂对PASMCs的PCNA表达影响：PCNA表达阳性的染色为棕黄色，位于胞核(图3、4，封二)。NFA和IAA-94对常氧各组的阳性表达率无影响，慢性低氧时PCNA 表达阳性率明显增高，NFA和IAA-94干预后表达的阳性率明显下降(P<0.01)，见表1。

　　2.4 ClCa阻滞剂对PASMCs c-fos 和c-jun 蛋白表达影响：c-fos的阳性表达为细胞胞质明显棕黄色染色，c-jun的阳性表达为细胞胞核明显棕黄色染色(图5、6，封二)。NFA和IAA-94对常氧各组的AIOD无影响，慢性低氧时c-fos和c-jun AIOD明显增高，NFA和IAA-94干预后AIOD明显下降(P<0.01)，见表2。表2 ClCa阻滞剂对常氧和慢性低氧PASMCs c-fos、c-jun蛋白表达的影响 注：*与Nc 组比较，P<0.01;#与Hc 组比较，P<0.01

　　3 讨论

　　血管平滑肌细胞分为收缩及合成表型，前者为去分化表型，后者为分化表型，是细胞发育和疾病状态下的表型，两者可发生相互转化并受到细胞因子、细胞外基质等多种因素的调节[5]。收缩型细胞胞质内含丰富的肌丝，而合成型细胞胞质中参与生物合成的内质网、线粒体及高尔基氏器含量较多，并分散存在一些肌丝束，缺乏收缩能力，但其移行、增殖以及分泌能力强[6]。现形态学观察发现，低氧时细胞由收缩型向合成型转化，这与以往研究报道一致;用ClCa阻滞剂NFA及IAA-94 干预后细胞又出现向收缩型转化趋势，提示ClCa可能参与了慢性低氧时PASMCs的形态改变。

　　细胞周期中，一些蛋白的合成对于细胞由G0G1期进入S期是必需的，如降钙素、DNA复制起始和进行的有关酶系及增殖细胞核抗原(PCNA)等，其中PCNA与细胞增殖明显相关[7]。PCNA是分子量为33-36kD的核蛋白，直接参与DNA的合成，是评价细胞增殖状态的一个重要指标[8]。现研究显示，慢性低氧时细胞核中PCNA蛋白表达增强，细胞周期提前，细胞增殖反应增强，与以往的研究相同[9];NFA和IAA-94可使体外培养的PASMCs提前的细胞周期恢复，细胞核中PCNA染色由强阳性明显减弱，提示ClCa可能参与了慢性低氧PASMCs的增殖。

　　我们以往的研究证实[10]，慢性低氧可引起PASMCs [Ca2+]i升高，而用NFA和IAA-94干预后升高的[Ca2+]i下降，提示ClCa参与了低氧时[Ca2+]i的升高。Ca2+是细胞增殖活动重要的第二信使。体外培养的脑及PASMCs Ca2+与细胞增殖关系研究表明[11]，[Ca2+]i 升高一方面激活胞浆中的收缩蛋白，另一方面激活细胞核P-CREB转录因子和迅速增加c-fos、c-jun等基因的表达。现研究发现，慢性低氧时一方面PCNA表达增强，细胞周期提前，平滑肌呈合成表型，另一方面，[Ca2+]i升高且c-fos和c-jun蛋白表达增强;而用NFA及IAA-94干预后结果正好相反，提示ClCa可能参与慢性低氧PASMCs的增殖。

　　综上所述，慢性低氧时，抑制ClCa可抑制细胞增殖，提示ClCa可能参与了低氧肺动脉平滑肌细胞增生、肥厚和血管壁重塑。这对于研究HPH的病理生理学改变有着重要意义，并为临床防治HPH提供了新的思路。

　　【参考文献】

　　[1] Mandegar M, Remillard CV, Yuan JX. Ion channels in pulmonary arterial hypertension[J]. Prog Cardiovasc Dis, 2002, 45(2)：81-114.

　　[2] 樊再雯, 张珍祥, 徐永健.钾通道对大鼠肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i的调节[J]. 中国病理生理杂志, 2004, 20(2)：150-153.

　　[3] Liantonio A, Giannuzzi V, Picollo A, et al. Niflumic acid inhibits chloride conductance of rat skeletal muscle by directly inhibiting the CLC-1 channel and by increasing intracellular calcium[J]. Br J Pharmacol, 2007, 150(2)：235-247.

　　[4] 孔　炜, 王迪浔. 慢性缺氧改变肺内动脉平滑肌细胞环氧合酶基因的表达[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2001, 24(9)：531-533.

　　[5] Mahoney WM, Schwartz SM. Defining smooth muscle cells and smooth muscle injury[J]. J Clin Invest, 2005, 115(2)：221-224.

　　[6] Sanchez O, Marcos E, Perros F, et al. Role of endothelium-derived CC chemokine ligand 2 in idiopathic pulmonary arterial hypertension[J].Am J Respir Crit Care Med, 2007, 176(10)：1041-1047.

　　[7] Hongo M, Mawatari E, Sakai A, et al. Effects of nicorandil on monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension in rats[J]. J Cardiovasc Pharmacol , 2005, 46(4)：452-458.

　　[8] Lehen KV, Flourakis M, Skryma R, et al. TRPV6 channel controls prostate cancer cell proliferation via Ca(2+)/NFAT-dependent pathways[J]. Oncogene, 2007, 26(52)：7380-7385.

　　[9] Das M, Bouchey DM, Moore MJ, et al. Hypoxia-induced proliferative response of vascular adventitial fibroblasts is dependent on g protein-mediated activation of mitogen-activated protein kinases[J]. J Biol Chem , 2001, 76 (19)：15631-15640.

　　[10] 杨朝, 张珍祥, 徐永健, 等.[Ca2+]i对大鼠肺动脉平滑肌细胞膜钙激活氯离子通道的调节作用[J].中国病理生理杂志, 2007,23(6)：1116-1119.

　　[11] Wellman GC, Nelson MT. Signaling between SR and plasmalemma in smooth muscle: sparks and the activation of Ca2+-sensitive ion channels[J]. Cell Calcium, 2003, 34(3)：211-229.