大鼠尿中木兰碱高效液相色谱测定法的建立

　　【摘要】 目的 建立高效液相色谱测定法测大鼠尿中木兰碱浓度。方法 采用Agilent ODS C18柱(4.6mm×250mm，5 μm)，柱温25℃，流动相为甲醇﹕KH2PO4溶液(0.05 mol·L1)=24﹕76(v﹕v)，流速：0.8 mL·min1。尿液样品用生理盐水稀释后与甲基叔丁基醚混合，上清液用40℃氮气吹干，残渣用流动相溶解进样。结果 标准曲线在0.05～6.00 μg·mL1范围内线性良好，最低检测限为0.01 μg·mL1，木兰碱及内标盐酸小檗碱的保留时间分别为7.95 min和11.02 min，日内和日间精密度RSD均小于11%，提取回收率在92%以上。结论 本法简便可靠，适用于大鼠尿液中木兰碱的测定及其药物动力学研究。

　　【关键词】 木兰碱;尿液;高效液相色谱法;大鼠

　　ESTABLISHMENT OF HPLC METHOD FOR

　　DETERMINATION OF MAGNOFLORINE IN RATS URINE

　　Long Qifu

　　(Qinghai University Medicai College)

　　Abstract Objective To establish a HPLC method for the determination of Magnoflorine in rat urine. Methods Analysis was performed on an Agilent C18 analytical column (4.6mm×250mm,5μm) with mobile phase consisting of methanol0.05mol·L1 potassium dihydrogen phosphate(24﹕76,v﹕v) at a flow rate of 0.8mL·min1. The urine sample was diluted by physiological saline and extracted with methyl tertbutyl ether. After evaporation of the organic layer, the residue was dissolved with mobile phase and injected into the column. Results The standard curve was linear over the concentration range of 0.05 to 6.00 μg·mL1.The lowest concentration of detection in urine was 0.01 μg·mL1. The retention time for Magnoflorine and Berberine was 7.95 min and 11.02 min respectively. The intra and inter day RSD were less than 11%, the extraction recovery was over 92%. Conclusion The method is simple and accurate and suitable for the determination of Magnoflorine in rat's urine and pharmacokinetics study.

　　Key words Magnoflorine Urine HPLC Rats

　　有关木兰碱尿药浓度测定方法国内外尚未见报道，仅有少量木兰碱含量测定的报道[1，2]。本文建立HPLC法测定大鼠尿液中木兰碱的浓度，为用尿药法进行木兰碱的药动学研究奠定基础。

　　1 仪器与试药

　　Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司，包括G1322A四元泵、G1315B二级管阵列检测器、G1316A色谱柱恒温箱、HP1090色谱工作站和G1329自动进样系统);Thermo低温离心机(美国);G560E型涡旋混合器(美国);KQ250B型超声清洗器(中国江苏昆山超声波仪器有限公司);气吹干仪、WM2H型无油气体压缩机(中国天津医疗器械二厂)。木兰碱对照品购于中国天津中新药业，经黑龙江中医药大学药学院生药教研室鉴定，批号：20080309，纯度≥98.0%;盐酸小檗碱对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：110713200208，纯度≥98.0%。甲醇、乙腈均为色谱纯，实验用水为重蒸馏水。

　　Wistar大鼠，♀♂兼半，体重(220±20)g(中国科学院上海动物实验中心提供，合格证沪动字第P00101006)。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件

　　色谱柱：Agilent C18柱(4.6mm×250mm，5 μm)，流动相为甲醇﹕KH2PO4溶液(0.05 mol·L1)=24﹕76(v﹕v)，流速：0.8 mL·min1, 紫外检测波长：282 nm,柱温25℃。

　　2.2 样品预处理

　　精密吸取尿液 50 μL，加5 mL生理盐水稀释，取稀释后尿液50 μL置10 mL具塞玻璃试管中，加入2 μg·mL1盐酸小檗碱(内标)溶液50 μL ，旋涡 30 s，加入5 mL甲基叔丁基醚，旋涡30 s，离心(10000 r·min 1 )10 min，定量转移上清液4 mL，置于40℃水浴中氮气吹干，残渣用100 μL流动相溶解，进样20 μL。

　　2.3 方法专属性考察

　　对空白尿液、空白尿液加入木兰碱和盐酸小檗碱对照品以及尾静脉给予10 mg/kg木兰碱后的尿液样品，按“2.2”项下操作，进行分析，得到色谱图(图1)。结果木兰碱与盐酸小檗碱的保留时间分别为7.95 min和11.02 min，分离度大于2.0，峰形尖锐，无拖尾现象。相应的理论塔板数>5000，尿样内源性物质不干扰木兰碱的含量测定。

　　2.4 溶液配制

　　木兰碱对照品溶液的配制：精密称取木兰碱对照品1.00 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解(超声助溶)并稀释至刻度，摇匀，即得100 μg·mL1的对照品贮备液，置4℃冰箱保存。

　　盐酸小檗碱溶液的配制：精密称取盐酸小檗碱0.20 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解(超声助溶)并稀释至刻度，摇匀，即得2 μg·mL1的内标贮备液，置4℃冰箱保存。

　　2.5 标准曲线制备

　　精密量取空白尿液50 μL，加5 mL生理盐水稀释，取稀释后尿液50 μL及木兰碱对照品溶液适量，配成木兰碱尿液浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00和6.00 μg·mL1的尿液样品，按“2.2”项下操作并进样20 μL。记录色谱峰面积，以样品峰与内标峰面积之比(As/Ai)为横坐标，木兰碱浓度为纵坐标进行回归，得标准曲线Y=5.4×104X1.041×103(r=0.9963)，木兰碱浓度在0.05～6.00 μg·mL1内线性关系良好，以S/N≥3计最低检测限为0.01 μg·mL1。

　　2.6 精密度实验

　　精密量取空白尿液50 μL，加5 mL生理盐水稀释，取稀释后尿液50 μL，按照尿药浓度配成含木兰碱0.20、1.00和4.00 μg·mL1的质量浓度样品，每个浓度平行做6份，按“2.2”项下操作，每个样品进样3次，连续测定3天。在1 d内用同台仪器和当日的标准曲线测定并计算日内精密度。连续3d用同台仪器及当日标准曲线测定并计算日间精密度。结果见表1。表1木兰碱尿样的日内和日间精密度

　　2.7 提取回收率

　　取稀释后的空白尿液50 μL配制含木兰碱为0.20、1.00和4.00 μg·mL1的质量浓度样品各6份，按“2.2”项下操作并进样，记录色谱图，木兰碱的峰面积为A1;另取一定量的木兰碱对照品贮备液，配成浓度为0.20、1.00和4.00 μg·mL1的系列标准溶液各6份以同体积进样，记录色谱图，木兰碱峰面积为A2，以(A1/A2)×100%计算提取回收率。结果见表2。表2木兰碱尿样的提取回收率

　　2.8 稳定性实验

　　长期稳定性：取稀释后的空白尿液50 μL加入一定量的木兰碱对照品贮备液，配制成浓度为0.20、1.00和4.00 μg·mL1的系列标准尿液QC样本各3份，于20℃分别冷冻 0、1、3、5、7、15、30、60 d后，取出待完全溶解后按“2.2”项下操作并进样分析，与 0 d 相比求得标准尿液样本的偏差。结果表明，标准尿液QC样本在 20℃条件下至少可保持60 d稳定，相对偏差在 8.71 %～4.96 %内。

　　冻融稳定性：取稀释后的空白尿液50 μL加入一定量的木兰碱对照品贮备液，配制成浓度为0.20、1.00和4.00 μg·mL1的系列标准尿液QC样本各3份，于 20℃分别冷冻24 h，取出待完全溶解后按“2.2” 项下操作并进样分析，反复冻融3次，与未冻前相比求得标准尿液样本的偏差。结果表明，标准尿液QC样本在3次冻融条件下可保持稳定，相对偏差在 5.15 %～6.84 %内。

　　室温稳定性：取稀释后的空白尿液50μL加入一定量的木兰碱对照品贮备液，配制成浓度为0.20、1.00和4.00 μg·mL1的系列标准尿液 QC样本各3份，于室温分别放置 0、2、4、6、8、12 h后按“2.2” 项下操作并进样分析，与 0 h相比求得标准尿液样本的偏差。结果表明，标准尿液 QC样本至少在12 h内可保持稳定，相对偏差在 3.68 %～5.22 %内。

　　2.9 木兰碱在大鼠尿液中的排泄

　　取6只大鼠，从尾静脉快速注射木兰碱(10mg·kg1)，将给药后的动物放入代谢笼中，收集0～4 h、4～8 h、8～12 h、12～24 h、24～36 h内的尿液，测量尿液于20℃保存。大鼠尾静脉给予木兰碱(10 mg·kg1)后累积尿药排泄率如图2。

　　3 讨论

　　实验初，曾采用乙腈三乙胺溶液、甲醇三乙胺溶液等作为流动相，色谱峰对称性均较甲醇 KH2PO4溶液差，拖尾严重。

　　木兰碱在尿液中稳定性较好，室温放置、反复冻融、长期放置均稳定。但尿液长期放置容易产生微生物而污染色谱柱，因此尿液样品最好采取低温保存且尽快测定。

　　尿液中的药物浓度受排泄量和尿液体积的影响很大，因此在试验中，应按固定间隔给动物灌予生理盐水以促进尿液排泄。

　　【参考文献】

　　[1]汪灿,伍城颖,汪文涛,等.HPLC测定刺壳花椒中木兰花碱含量的研究[J].中国中药杂志,2009, 7(34) :922

　　[2]陈翠萍,沙明,杨松松,等.朝鲜淫羊藿中木兰碱的定量研究[J].中国中药杂志,1996,21(11):681