人血浆中病毒唑浓度的高效液相色谱测定法建立

　　【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定人血浆中病毒唑的浓度。方法 采用液液提取法处理血浆样品，色谱柱为C18 (250mm×4.6mm， 5 μm )，流动相为 50mM (pH=3.23)的磷酸缓冲液和乙腈，流速为1.0 ml· min1，紫外检测波长为235 nm，柱温为25 ℃。结果 血浆中内源性物质对样品测定无干扰。血浆中病毒唑浓度在 0.08～10.0 μg · ml1范围内，线性关系良好(r=0.9971)，最低定量浓度为0.08 μg · ml1，平均提取回收率为82.3% ,日内、日间RSD分别小于7.2%和11%。结论 本法简便、快速、准确,适用于病毒唑的血药浓度监测和药代动力学研究。

　　【关键词】 病毒唑 高效液相色谱 血药浓度

　　THE METHOD OF HIGH PERFORMANCE LIQUIDCHROMATOGRAPHY FOR DETERMINATION OF

　　RIBAVIRIN IN HUMAN PLASMA

　　Li Yongfang，Chen Xianghong

　　(Department of Pharmacology, Qinghai University Medical College)

　　Abstract Objective To establish a High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method for the determination of Ribavirin in human plasma. Methods Plasma samples were prepared by liquid/liquid extraction. Ribavirin were separated on a Diamonsil C18 (250mm×4.6 mm，5μm)with the mobile phase consisted of 50mM phosphate buffer(pH =3.23 ) and acetonitrile at a flow rate of 1.0 ml· min1 at 25 ℃,the detection wavelength was set at 235 nm. Results The blank plasma did not interfere with the determination of ribavirin. There is a good linear relationship within the range of 0.08～10.0μg · ml1 (r = 0. 9971), The limit of quantitation was 0.08μg · ml1 .The average extraction recovery was 82.3%.The intraday RSD and interday RSD were less than 7.2% and 11% respectively. Conclusion The method is simple, rapid and accurate.It is suitable for the therapeutic drug monitoring and the pharmacokinetic study of Ribavirin.

　　Key words Ribavirin Concentration in plasma HPLC

　　近年来有关病毒唑 (ribavirin)不良反应的案例日趋增多。这种不良反应的发生和其抗病毒作用都呈浓度依赖性 [1]。因此病毒唑的血药浓度监测对于达到理想化的治疗具有很重要的意义。

　　关于病毒唑的血药浓度测定，国内外已有一些文献报道，包括高效液相色谱 [2～4]法和液相色谱串联质谱(LCMS/MS) [5～7]法，其中有的方法灵敏度虽高，但分析的线性范围窄 [3，4，6，7]，此范围不能包括用病毒唑治疗的肝炎病人血浆最高浓度(4.519 μg·ml1) [8]，不能满足病毒唑血药浓度的监测;有的方法样品处理繁琐，操作方法复杂，所需仪器和试剂较多 [2，5～7]。本研究旨在建立一个简单、有效、快速、低廉的血浆病毒唑测量方法。

　　1 仪器与试药

　　Merckhitachi LaChrom 高效液相色谱系统仪(德国，Merck);病毒唑(意大利，sigmaAldrich，批号：030630);已腈、甲醇(色谱纯，荷兰，J.T Baker);磷酸和磷酸二氢钾(分析纯，荷兰，J.T Baker);空白血浆(健康志愿者，弗朗孔岱大学医学院血液科提供)。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件选定

　　色谱柱为C18 (250mm×4.6 mm， 5 μm ，VARIAN公司)，流动相为50 mM磷酸缓冲液(pH=3.23)和乙腈，梯度洗脱程序为0～3 min，磷酸缓冲液—乙腈，100：0(V/V);4～9 min，磷酸缓冲液—乙腈，80：20(V/V);10～14 min，磷酸缓冲液—乙腈，100：0(V/V)，流速为1.0 ml·min1，紫外检测波长为235 nm，柱温为25 ℃。

　　2.2 标准贮备液配置

　　称取适量病毒唑用甲醇配制成浓度为 0.1 mg·ml1的标准液 ,置 4℃冰箱保存。

　　2.3 血浆样品处理

　　取125 μl血浆样品, 加入750 μl 乙腈, 振摇混匀, 离心(1000转/分) 10 min后，取有机相，行50 ℃水浴并用氮气吹干，再加入70 μl 磷酸缓冲液，混匀后，取20μl进样。

　　2.4 选择性和特异性测定

　　按“2.1”所示色谱条件、“2.3”所示血浆样品处理方法，测得空白血浆、空白血浆加病毒唑的色谱图(图1)。由图1可见，血浆中杂质不影响病毒唑的分离测定，内源性物质峰与样品峰分离良好。病毒唑的保留时间为4.62 min。

　　在同一色谱条件下，对临床常用的抗感染药物以及可能和病毒唑合用的药物如丙戊酸、苯妥英、庆大霉素、卡马西平、茶碱、他克莫司、万古霉素、卡那霉素、地高辛、环孢菌素和抗反转录病毒药等进行了实验考察。结果显示，上述药物在病毒唑的保留时间附近均无“峰”出现，对病毒唑的分离无干扰。

　　2.5 标准曲线绘制

　　取空白血浆125 μl，准确加入病毒唑贮备液，分别配制成浓度为0.08、0.80、2.00、3.20、6.00和10.00 μg · ml1的含药血浆，然后按“2.3”项下方法操作后进行分析，以病毒唑浓度(x)为横坐标，病毒唑的峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：y=91127x5006.2，r=0.9971。结果显示，血浆中病毒唑浓度在 0.08～10.0 μg · ml1 范围内时其线性关系良好，血浆中病毒唑的最低定量浓度为0.08 μg · ml1。

　　2.6 绝对回收率试验

　　配制高、中、低三个血药浓度(分别为10.0、3.2、0.2 μg · ml1)的血浆样本各5份。按“2.3”项下方法操作，记录病毒唑的峰面积。另取相应浓度的标准品，用氮气在50℃温度下吹干，加70 μl磷酸缓冲液，按同样方法进样测定，记录病毒唑的峰面积。用两组峰面积比值计算血浆中病毒唑的绝对回收率，结果见表1。表1血浆样品中病毒唑的提取回收率

　　2.7 精密度试验

　　取空白血浆125 μl，准确加入病毒唑标准贮备液，配制成相当于血药浓度为0.2、3.2和10.0 μg·ml1的样品溶液，按“2.3”项下方法操作后进行分析。每个浓度分别在1日内重复处理并测定10次，计算日内精密度;每个浓度分别在不同日内(连续5天)处理并测定其浓度，计算日间精密度，结果见表2。表2血浆样品中病毒唑精密度测定结果

　　2.8 室温、冻融试验

　　空白血浆中加入适量标准贮备液，配置成浓度为3.2 μg·ml1的血浆样本，分成3份，分别置于 25℃、4℃和20℃保存。并于第0、1、2、15、16和21天按“2.3”项下方法操作后进行分析，考察其在25℃、4℃和20℃条件保存下的稳定性，结果显示，在25℃保存下血浆中病毒唑很不稳定，1天后相对误差为12.4，2、15，21天后相对误差分别为23.5、28.5和33.9。而在4℃和20℃条件下保存，比较稳定，放置21天相对误差分别为10.1和3.2。所以取样后必须当天分析或置于20℃环境保存，结果详见表3。表3血浆中病毒唑的稳定性试验结果

　　2.9 临床血浆样品测定

　　选择接受病毒唑治疗的丙型肝炎住院病人3例(法国弗朗孔岱大学医学院提供),分别取血样,置于5 mL肝素管中,离心分离血浆。按“2.3 ”项下方法操作后进行分析,代入标准曲线计算,得到病人病毒唑的血药浓度分别为2.642、3.169和2.970 μg· ml1。

　　3 讨论

　　本试验以乙腈为提取溶剂 ,提取 1次其提取回收率即可大于80%，较稳定且操作方法简单易行。我们在不同时间内采用不同比例的磷酸缓冲液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，经过多次实验对比，设定梯度洗脱程序：0～3 min，磷酸缓冲液—乙腈，100：0(V/V);4～9 min，磷酸缓冲液—乙腈，80：20(V/V);10～14 min，磷酸缓冲液—乙腈，100：0(V/V)，并调节流速至1.0 ml·min1、柱温为25 ℃时，获得了较好的洗脱效果(洗脱时间短，与血浆中杂质分离良好，其他药物干扰少)。有文献[3～4]报道紫外检测波长为207 nm，但本实验经过多次摸索发现检测波长为235 nm时，吸收峰较好。在本实验条件下，标准曲线浓度范围广，此范围包括文献所报道的以病毒唑治疗的肝炎病人血浆最高峰浓度(4.519 μg · ml1)和最低谷浓度(0.518 μg · ml1)[8]。利用本法对临床上3例病毒唑治疗的肝炎病人血浆药物浓度进行了测定,测得浓度与文献[8]报道的浓度范围相符,且方法重现性好,无其他药物干扰。

　　本实验所建立的病毒唑血浆药物浓度HPLCUV测定法，方法简单、快速、可靠，适用于病毒唑的血药浓度监测和药代动力学研究。

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