硫化氢对氧应激大鼠肝星形细胞的影响

　　【摘要】 目的 探讨硫化氢(H2S)对大鼠肝星形细胞(HSC)增殖和氧应激的影响。方法 用铁超载的方法复制肝纤维化的氧应激模型，给予外源性H2S供体硫氢化钠(NaHS)和炔丙基甘氨酸( PPG，H2S合成关键酶胱硫醚γ裂解酶CSE抑制剂)，通过绘制生长曲线法和用CCK8细胞计数法测定不同浓度H2S和PPG分别作用于500 μmol/L次氮基三乙酸铁(FeNTA) 培养下的HSC 6、12、24 h细胞上清液和裂解液中H2S浓度、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量，通过检测HSC的增殖情况、CSEmRNA表达水平、H2S浓度和氧化抗氧化指标(MDA、SOD)来探讨H2S对HSC氧应激的影响。结果 FeNTA所致的增殖HSC氧应激损伤明显增加，抗氧化能力减弱。同时，CSEmRNA表达水平低下，H2S产生减少。给予PPG后，HSC增殖显著且CSEmRNA表达受到抑制。内源性H2S随着严重的氧应激损伤进一步减少。给予NaHS后，HSC增殖减少，CSEmRNA表达和H2S产生显著增加以缓解氧应激损害和增强抗氧化能力。结论 H2S对HSC增殖具有一定的抑制作用，对FeNTA诱导的氧应激具有保护作用。

　　【关键词】 肝纤维化;肝星形细胞;硫化氢;氧化应激

　　EFFECTS OF HYDROGEN SULFIDE ON RATHEPATIC STELLATE CELLS IN OXIDATIVE STRESS

　　Wang Hongbin , Fan Haining，Deng Yong

　　Department of Hepatobiliary Surgery，

　　the affiliated hospital of Qinghai University

　　Abstract Objective To explore the effects of hydrogen sulfide on proliferation and oxidative stress of hepatic stellate cells HSC in rats. Methods Ironoverloaded method was used to establish the liver fibrosis model characterized by oxidative stress.After the NaHS(H2S donor)and the propargylglycine (PPG，a metabolic enzyme inhibitor of H2S) were given，the growth curves was drawn and CCK8 was measured by cell counting to reveal the effects of various concentrations of H2S and PPG on proliferation of HSC functioned with ferric nitrilotriacetic acid (FeNTA)(500 μmol/L).After being given H2S and PPG， the concentrations of H2S in cell lysate supernatant and cell lysis solution，the activity of superoxide dismutase(SOD) and the contents of maleic dialdehyde(MDA)were detected after six hours，twelve hours and twentyfour hours respectively. In order to observe the effects of hydrogen sulfide on oxidative stress， the effects of FeNTA on the proliferation of HSC， the expression of CSEmRNA，MDA contents and SOD activity were detected respectively after giving FeNTA，NaHS and PPG. Results FeNTA induced Oxidation damage of proliferated HSC was ncreased significantly with weakened antioxidant ability， meanwhile，the CSE mRNA expression were lower and the production of H2S decreased. After being given PPG， the proliferation of HSC accelerated and the CSE mRNA expression were restrained. At the same time，endogenous H2S decreased further with severe oxidation damage. After being given NaHS，the proliferation of HSC decelerated and the CSE mRNA expression and the production of H2S increased markedly to alleviate oxidation damage and strengthen the antioxidant ability. Conclusion H2S has inhibitory effect on proliferation of HSC and protective effect on oxidative stress induced by FeNTA.

　　Key words Liver fibrosis Hepatic stellate cell Hydrogen sulfide Oxidative stress

　　H2S是近年来发现的一种继CO、NO之后的第三种气体信号分子。内源性H2S由半胱氨酸在胱硫醚β合成酶(CBS)、CSE和半胱氨酸转移酶催化产生，1/3以H2S形式存在，2/3以NaHS形式存在[1]。近年来人们逐渐发现H2S具有多种生理功能。在神经功能调节、平滑肌舒张[2]、血管重构[3]、炎症反应及肝纤维化中有一定的作用。肝实质细胞和HSC可以表达H2S生成关键酶CSE，HSC的活化可以导致CSEmRNA的下调，H2S生成减少。H2S具有舒张血管，抑制Ⅰ、Ⅲ形胶原合成作用，它的减少可能会促进门脉高压和肝纤维化的形成。为了探讨H2S与肝纤维化的关系，我们利用铁超载的方法在体外复制肝纤维化的氧应激模型，给予外源性H2S供体NaHS和H2S合成关键酶CSE抑制剂PPG，通过检测HSC的增殖情况、CSEmRNA表达水平、H2S浓度和氧化抗氧化指标(MDA、SOD)来探讨H2S对HSC的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　大鼠肝星形细胞(HSCT6)购自湖南长沙万百生物公司。DMEM培养基为Gibco 公司产品，胎牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒为南京建成生物工程公司产品。CCK8细胞计数试剂盒购自上海同仁化学研究所。CO2培养箱(Thermo公司)，倒置相差显微镜(Nikon公司)，酶标仪和凝胶成像分析系统(BioRad公司)，PXS270离子计和敏感硫电极(上海雷磁公司)，PCR 扩增仪(Eppendorf公司)。二甲亚砜(DMSO)、硫氢化钠(NaHS)、枸橼酸铁胺(Ferric ammonium citrate)、次氮基三乙酸二钠(NTA)、炔丙基甘氨酸(propargylglycine ，PPG)均为 Sigmaaldrich公司产品。次氮基三乙酸铁(Ferric nitrilotriacetate, FeNTA): 将470 mgNTA溶于100 ml双蒸水，调整pH至2.0,将200 mg Ferric ammonium citrate加入该溶液彻底溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌，调整pH至7.0,使终浓度为10 mM，使用时稀释至500 μmol/L。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 实验分组及药物浓度梯度设定

　　空白组(B组)： HSCT6。

　　对照组(C组)： HSCT6+500 μmol/L FeNTA。

　　NaHS组(N组)：

　　N1：HSCT6+500 μmol/L FeNTA+20 μmol/L NaHS;

　　N2：HSCT6+500 μmol/L FeNTA+100 μmol/L NaHS;

　　N3：HSCT6+500 μmol/L FeNTA+200 μmol/L NaHS。

　　PPG组(P组)：

　　P1：HSCT6+500 μmol/L FeNTA+7×105mol/L PPG;

　　P2: HSCT6+500 μmol/L FeNTA+2×104mol/L PPG;

　　P3: HSCT6+500 μmol/L FeNTA+7×104mol/L PPG。

　　1.2.2 细胞增殖实验

　　取对数生长期的HSCT6以0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为5×107/L，接种于96孔培养板中，每孔加入100μl细胞悬液，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养48　h，换用无血清DMEM培养基继续培养24　h，使细胞同步化。将细胞分为B组、C组、NaHS组(N1、N2、N3组)、PPG组(P1、P2、P3组)，每组设三个复孔，弃去旧培养基，分别加入100μl含相应试剂的DMEM培养基，分别在培养6、12、24　h后测定吸光度值。以时间(6、12、24h)为横坐标，吸光度为纵坐标做生长曲线。

　　1.2.3 细胞上清液及裂解液上清液H2S测定

　　取对数生长期的HSCT6调整细胞浓度至5×107/L后接种于24孔培养板中，每孔加入2ml细胞悬液，细胞同步化与分组、孵育等过程均同细胞增殖实验。其后取培养液上清液及裂解液上清液，将待测样品与抗氧化液按1:1混合，通过敏感硫电极法[4]测定样品S2浓度，以标准S2溶液测定值做标准曲线，从而间接反映H2S浓度。

　　1.2.4 细胞上清液中SOD活性和MDA含量检测

　　取对数生长期的HSCT6调整细胞浓度至5×107/L后接种于96孔培养板中，每孔加入200 μl细胞悬液，细胞同步化与分组、孵育等实验过程均同细胞增殖实验。其后取培养液上清液测定SOD浓度和MDA含量。步骤按试剂盒要求进行。

　　1.2.5 细胞裂解液中SOD活性检测

　　每孔加入1 ml PBS液，用刮刀刮下细胞，收集到离心管中，离心(4℃，2000 rpm)10 min，弃上清液。向离心管内再次加入1 ml PBS洗涤细胞，离心(4℃，2000 rpm)10 min，弃上清液。加入1 ml PBS悬浮细胞，20℃放置20 min,37℃水浴放置10 min,重复该步骤两遍。破碎细胞膜，加入PBS 1 ml,离心(4℃，10000 rpm)15 min，取上清液用PBS稀释，制成样品溶液，用SOD试剂盒检测细胞裂解液中的SOD活性。步骤按说明书进行。

　　1.2.6 胱硫醚γ裂解酶(CSE)的半定量RTPCR测定

　　提取RNA，取出5 μl RNA溶液，混合1 μl琼脂糖凝胶电泳加样缓冲液(含0.25%溴酚兰，40%蔗糖)。上样于1%的琼脂糖凝胶(含有0.05 μl/ml EB),120V电泳15 min，紫外分析仪下观察，将符合条件的RNA置于70℃保存备用。用无Rnase水对待测RNA样品做1：20稀释，充分混匀。用无Rnase水作为空白对照，在波长260 nm处调节紫外分光光度计读数至零，然后用紫外分光光度计分别测定样品在260 、280 nm时的OD值。OD 260/OD 280为1.8～2.0之间的RNA用于后续实验。总RNA经纯度和浓度鉴定符合要求后，制备cDNA。引物设计根据NCBI核酸数据库公布的引物序列设计引物。

　　GAPDH:

　　P1:ATGACTCTACCCACGGCAAG

　　P2:TACTCAGCACCAGCATCACC

　　CSE:

　　P3:GTATTGAGGCACCAACAGGT

　　P4:GTTGGGTTTGTGGGTGTTTC

　　1.3 统计学处理方法

　　采用SPSS11.5软件进行统计分析，结果以x±S 表示。显著性检验用单因素方差分析(oneway ANOVA),两两比较用StudentNewmenKuels q检验，裂解液H2S与裂解液SOD相关系数采用Pearson相关分析，检验水准取α = 0.05。

　　2 结 果

　　2.1 培养液上清液中H2S浓度

　　给予FeNTA 6 h后, H2S浓度下降，随着时间的延长，对照组与空白组有差异(P<0.01)。给予NaHS治疗后，与C组相比，除6 h N1组外，其余各处理组均能够在6、12、24 h后显著提高H2S浓度(P<0.05)。给予PPG后，与C组相比，处理6 h的P1、P2组H2S浓度无明显差异，其余各组差异均有明显性(P<0.05)，见表1。表1各组培养液上清液H2S浓度

　　2.2 裂解液中H2S的浓度

　　给予FeNTA后H2S浓度降低，对照组和空白组存在显著差异(P<0.01)。给予NaHS 12、24 h后N1、N2、N3与对照组均存在差异(P<0.05)。6 h时 N1和N2组与对照组相比差异不明显，N3组与对照组相比存在差异(P<0.05)。给予PPG后6、12和24 h P1、P2 、P3组与对照组相比均存在差异(P<0.05)，见表2。表2各组裂解液H2S浓度

　　2.3 培养液上清液中MDA含量

　　给予FeNTA后6 h和12 h时对照组和空白组MDA含量差异不明显，24 h后对照组和空白组有差异(P<0.05)。给予NaHS后6 h和12 h时处理组与对照组均无明显差异，24 h 和N3组与对照组比较均有明显差异(P<0.05)。给予PPG治疗后6 h和24 h的P2、P3组，12 h的P3组与对照组均有明显差异(P<0.05)。各处理组随着时间的延长除P1组在6、12 h时差异不明显外，其余各时间组间均有差异(P<0.05)，见表3。表3各组培养液上清液MDA含量

　　2.4 培养液上清液中SOD活力

　　给予FeNTA有降低培养液上清液中SOD活性的作用，在6、12、24 h对照组与空白组均有差异(P<0.05)。给予NaHS后，12 h与24 h各组与对照组比较均有差异(P<0.05)。给予PPG后，6 h与12 h的P2、P3组，24 h的各处理组与对照组在相同时间点均存在差异(P<0.05)，见表4。　表4各组培养液上清液SOD活力

　　2.5 裂解液中SOD活力

　　给予FeNTA能降低裂解液中SOD的活性，对照组在各时间点与空白组相比都存在差异(P<0.05)。给予NaHS 12h、24 h时各处理组与对照组均存在差异(P<0.05)。给予PPG后，P3组在24 h时与对照组相比存在差异(P<0.05)，见表5。表5各组裂解液SOD活力

　　2.6 CCK8测定生长曲线

　　无FeNTA干预的正常细胞组6 h和12 h之间无明显差异，但两者与24 h组均存在差异(P<0.05)。给予FeNTA后，6 h组促增殖作用不明显，12、24 h对照组与空白组相比均存在差异(P<0.05)。给予NaHS治疗后，12 h的N3组、24h的各组与对照组相比，均有显著差异(P<0.05)。给予PPG后，除6 h P1组，24 h P1、P2组外，其余各组在相应时间点与对照组均有差异(P<0.05)，见表6。表6不同处理因素对HSCT6增殖的影响

　　2.7 半定量RTPCR法检测CSEmRNA凝胶成像系统分析结果

　　给予FeNTA后6 h ，与B组相比CSEmRNA表达开始出现下调。随着时间的延长，差异显著(P<0.05)。给予NaHS后，CSEmRNA表达上调，6 h组与C组相比，差异不明显。12、24 h组与C组相比有显著性差异(P<0.05)。给予PPG后，随着时间的延长，差异显著。表7CSEmRNA RTPCR结果分析 注：* 与B组比较P<0.05;△ 与C组比较P<0.05.

　　2.8 H2S与MDA、SOD的相关关系

　　经Pearson相关分析发现，6 h上清液H2S含量与MDA、SOD相关系数分别为0.776、0.927(P<0.05)，12 h上清液H2S含量与MDA、SOD相关系数分别为0.727、0.881(P<0.05)，24 h上清液H2S含量与MDA、SOD相关系数分别为0.867、0.980(P<0.05)，裂解液H2S与SOD 6、12、24 h相关系数分别为0.927、0.965、0.885。说明H2S与SOD存在正相关，而与MDA存在负相关。相关系数的绝对值均>0.70，说明它们之间高度相关。

　　3 讨论

　　肝纤维化的机制非常复杂。肝细胞的炎症、坏死、免疫反应、HSC的活化、脂质过氧化物的大量外溢都可以引起肝纤维化。HSC的活化是肝纤维化发生的中心环节，各种致纤维化因素最终都会以HSC为靶标，最终激活HSC。

　　研究表明，HSC的持续激活是肝纤维化发生发展过程中的关键环节。正常情况下HSC处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，邻近的细胞，如肝细胞、枯否细胞、窦内皮细胞和血小板等通过旁分泌作用可分泌多种细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNFα)、转化生长因子p(TGFp)、胰岛素生长因子(IGF1)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、内皮素1 (ET1)等，作用于HSC并使之出现肌成纤维母细胞(MFB)样表型转化[5] ，从而激活HSC，表现为HSC大量增生、胞体增大、Vit A脂滴消失、胶原纤维等细胞外基质分泌增多，表达α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和desmin等收缩性蛋白，同时还表达多种血管活性物质的受体。能对ET1、NO等多种血管活性物质产生收缩和舒张反应。一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高，另一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，这两类变化最终奠定了肝纤维化、门静脉高压症发病的病理学基础[6]。

　　SOD是机体抗氧化损伤防御体系中最重要的抗氧化酶之一，反映了机体清除氧自由基的能力[7]。MDA是脂质过氧化的重要终产物之一，反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，可促进I 型胶原的mRNA表达，与HSC增殖和胶原合成密切相关[8]。

　　铁沉积既直接激活HSC,又可以通过脂质过氧化反应导致HSC的间接激活。 刘梅等应用不同浓度的FeNTA培养大鼠HSC证实铁剂可以引起鼠HSC的增殖，导致氧化抗氧化失衡[9]。本实验通过给予FeNTA处理HSCT6也发现了类似的现象，提示运用铁超载的方法促进HSC增殖是一种可靠的肝纤维化模型。通过本实验，我们发现FeNTA造成的氧应激可明显升高MDA含量，且细胞上清液和细胞裂解液中SOD活性明显降低，呈现出一定剂量依从关系。这与刘梅等的研究结果相同。

　　近年来，随着对机体内源性气体信号分子研究的深入，发现内源性H2S气体具有调节神经系统、消化系统以及心血管系统等功能的作用，成为继NO和CO之后发现的又一种新的气体信号分子[10]，越来越受到人们的关注。作为一种新型的气体信号分子，H2S可以独立或与其他信号分子协同，在机体生理及病理生理功能的调节中发挥着重要作用[11]。催化它产生的酶主要有CBS、CSE和半胱氨酸转移酶。CSE主要在主动脉、肺动脉、门静脉表达，CBS主要在神经系统内表达。内源性H2S作为气体小分子可以自由通过细胞膜，作用不依赖于相应的质膜受体;在CSE和CBS催化下产生，受到体内代谢途径的调控[12];在生理浓度下具有开放KATP通道，抑制Ca2+内流，氧化还原等特定的生理功能[13，14];其细胞学效应可以依赖或不依赖第二信使cAMP介导，具有特定的细胞和分子作用的靶点[15]。在低氧性肺动脉高压中，H2S含量下降，给予外源性H2S可以缓解肺动脉压力的升高。在肺动脉高压发生中，CSE mRNA表达下调，H2S生成减少，提示H2S可能参与了肺动脉高压的发病过程。 Stefano Fiorucci通过研究H2S在正常和肝硬化大鼠肝组织中的作用发现，H2S是一种具有舒血管效应的气态信号分子，HSC的激活能够下调CSE mRNA的表达，从而减少H2S的产量，H2S含量的减少促进了门脉高压的形成，加快了肝纤维化的进程，形成恶性循环[16]。本实验通过铁超载促进HSC增殖复制肝纤维化模型也发现激活的HSC中，CSE表达下调，H2S含量减少。给予外源性H2S供体NaHS能够上调CSE水平，增加H2S含量，缓解HSC增殖。提示H2S能够在一定范围内抑制HSC的增殖，减少氧化损伤，提高抗氧化能力，对肝纤维化具有一定的抑制作用。

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