灵芝孢子粉对戊四氮致痫大鼠大脑皮质及海马区PCNA变化的影响

　　【摘要】 目的：探讨灵芝孢子粉对戊四氮(PTZ)致痫大鼠大脑皮质及海马区增殖细胞核抗原(PCNA)变化的影响，进一步研究癫痫的发病机制及灵芝孢子粉的干预机制。方法：免疫组织化学法(SABC法)检测皮质和海马区PCNA的免疫反应性;Western-blot检测海马区PCNA蛋白含量的变化。结果：癫痫模型组PCNA阳性细胞数目明显增多与对照组比较差异有显著性(P<0.01)，灵芝孢子粉干预组与癫痫模型组比较PCNA阳性细胞数明显减少差异有显著性(P<0.01);PCNA在戊四氮致痫组的大脑海马区的蛋白含量与对照组比较差异有显著性(P<0.01)，灵芝孢子粉干预组与癫痫模型组比较差异有显著性(P<0.01)。结论：灵芝孢子粉可以通过调节PCNA含量抑制星形胶质细胞(AS)增生，从而影响戊四氮致痫大鼠癫痫发作的发生与发展。

　　【关键词】 灵芝孢子粉;癫痫;戊四氮;星形胶质细胞;增殖细胞核抗原

　　Comparison of conventional nursing with evidence-based nursing after total hip replacement

　　WANG Xianmei

　　(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

　　Abstract:Objective：To explore the implementation effect of postoperative evidence-based nursing in the patient of total hip replacement.Methods：We selected 240 patients of total hip replacement receiving evidence-based nursing from 2005, and divided them into the conventional nursing group and evidence-based nursing group to compare the nursing effectiveness.Results：The patient satisfaction rate was obviously increased, the incidence of complications was significantly reduced and average hospitalization days were decreased in the evidence-bases nursing group compared with the control group,with a significant difference between the two groups(all P<0.05).Conclusion：The implementation of the post-operative evidence-based nursing in the the patients of total hip replacement can improve service level and nursing quality.

　　Key words:total hip replacement; post-operative nursing; evidence-based nursing; contrastive analysis

　　癫痫(Epilepsy EP) 是一组由大脑神经元高度同步化异常放电所引起的短暂中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病,具有突然发生、反复发作，可自然缓解的特点[1]。癫痫的病因，发病机制，演变过程十分复杂，迄今尚未完全明确。目前，针对癫痫发病机制的研究表明，作为神经系统重要组成成分的神经胶质细胞(AS)在中枢神经系统病变中扮演重要角色，几乎所有的癫痫病例手术切除标本及动物实验模型中均可见到神经胶质细胞的增生。AS是中枢神经系统中主要的大胶质细胞，对神经元的营养，支持，修复，再生起到重要作用，同时对有害刺激产生强烈反应，因此，AS的反复增殖活化与癫痫的发生演变的密切相关性越发受到重视。我国药用植物资源丰富，灵芝孢子粉作为一种名贵中草药，含有丰富的营养物质，如氨基酸及微量元素等，能有效调节机体免疫力，清除氧自由基，增加耐低氧能力，降脂，保肝，抗衰老，抗肿瘤，并能稳定膜离子通道，减轻钙超载，而且对神经系统还具有镇静和保护功能，降低受损伤神经元的死亡率[2～6]。本实验通过对PCNA的检测，探讨灵芝孢子粉对戊四氮致痫大鼠中枢神经系统星形胶质细胞增殖活化的影响，进一步研究癫痫发病机制及灵芝孢子粉作用机制，为寻找合理有效抗癫痫药物提供一些理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　健康雄性Wistar大鼠30只，体重(200±20)g，购自佳木斯大学实验动物中心，随机分为对照组、癫痫模型组和灵芝孢子粉干预组，每组各10只。

　　1.2 模型制备

　　癫痫模型组和灵芝孢子粉干预组用亚惊厥剂量的PTZ(35mg/kg体重) 腹腔注射，注射时浓度为10g/L，每日1次，持续28d，同时对照组以等容生理盐水腹腔注射;灵芝孢子粉干预组经灌胃给予灵芝孢子粉(150mg/kg体重)，灌胃时浓度为30g/L;同时癫痫模型组和对照组以等容生理盐水灌胃。

　　1.3 行为学观察

　　每天对每只大鼠在PTZ注射后进行观察并记录癫痫发作的潜伏期，发作级别及持续时间，用药28d后停药一周，再用相同剂量的PTZ测试，凡出现连续5 次Ⅱ级以上痫性发作为达到点燃标准。

　　1.4 免疫组织化学

　　实验动物麻醉后断头处死，在低温条件下迅速取脑，中性甲醛固定包埋，用切片机在视交叉后2mm，按5μm每层进行冠状切片，制片后备用。0.3%H2O2室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶的活性;抗原修复;山羊血清封闭;依次加一抗(兔抗大鼠PCNA多克隆抗体，1：100，北京博奥森生物技术有限公司)，37℃水浴箱孵育90min;AP标记的生物素化山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，37℃孵育20min;试剂SABC 37℃孵育20min。DAB显色(2～5min，PCNA阳性反应产物为棕黄色，位于胞核)，脱水，透明，封片。光镜下观察。

　　1.5 Western-blot

　　动物分组与模型制备同步骤一、二，冰上迅速分离海马，冰上匀浆10min，加入裂解液裂解30min，4℃下12000rpm离心15min，取上清备用。蛋白定量测定后，蛋白样品采用10%的SDS-PAGE 进行电泳分离, 然后转至PVDF 膜作免疫反应。浸入封闭液4℃过夜，然后依次加入适宜浓度的兔抗大鼠PCNA多克隆抗体，37℃孵育2h, 适宜浓度的生物素化的山羊抗兔IgG抗体37℃孵育1h, BCIP-NBT显色(1：50，武汉博士德生物工程有限公司)。各反应间用缓冲液充分洗涤。拍摄滤膜图片留作永久性实验记录，用凝胶图象处理系统分析目的条带的分子量和净光密度值。

　　1.6 图像分析及统计学处理

　　每只实验动物标本随机选择4个切面，每张切片随机选择5个400倍视野(共20个视野/ 只)，记录每400倍视野阳性细胞数用BI-2000医学图像分析系统分析PCNA免疫反应性，Western-blot 结果用GIS凝胶图像处理系统分析，实验中所得计量资料数据结果均以(平均数±标准差)表示，多组之间的比较用方差分析，显著性水准为0.05，使用SPSS for Windows 11.5统计软件包进行统计。

　　2 结果

　　2.1 行为学观察

　　对照组无痫样发作，癫痫模型组有重度的痫样发作(Ⅳ～Ⅴ级)，灵芝孢子粉干预组有轻度的痫样发作(Ⅰ～Ⅱ级)，与癫痫模型组动物相比，灵芝孢子粉干预组大鼠潜伏期明显延长，发作级别降低，少有大发作。

　　2.2 PCNA免疫组化结果

　　癫痫模型组大脑皮质及海马PCNA免疫反应阳性细胞数比空白对照组明显增多，差异具有显著性(P<0.01)，灵芝孢子粉组大脑皮质及海马PCNA免疫反应阳性细胞数比癫痫模型组明显减少，差异具有显著性(P<0.01)。(见表1与图1，图2)。表1 大脑皮质和海马区PCNA阳性细胞数的变化(略)

　　2.3 Western-blot检测海马区PCNA蛋白含量

　　PCNA分子量为36KD，内参为43KD。空白对照组海马区PCNA表达量很少，PTZ致痫后大鼠大脑海马区PCNA表达量明显增加,差异有显著性(P<0.01)，灵芝孢子粉干预组PCNA表达量与癫痫模型组相比较明显减少，差异有显著性(P<0.01)。(见表2，图3)。表2 海马区CyclinD1与PCNA蛋白含量变化(略)

　　3 讨论

　　AS是中枢神经系统重要的组成部分，其不仅发挥营养支持及协助代谢的功能同时参与CNS的信息传递与整合。PCNA是一种核内蛋白质，是DNA聚合酶δ的辅助蛋白[7，8]，可以与CDK抑制剂P21、CyclinD1和CDK结合形成复合物，并能刺激CyclinD1-CDK复合物对DNA连接酶的磷酸化，从而参与正常的DNA复制、细胞周期的转变和受损DNA的切除修复过程，与细胞的增殖周期密切相关，其表达程度反映了细胞增殖活性的高低，是反映细胞增殖情况应用最普遍的抗原标记。本实验免疫组化结果显示,癫痫模型组与空白对照组相比较PCNA阳性细胞数明显增多，表明细胞增殖活性增强。而灵芝孢子粉治疗组PCNA阳性细胞数明显低于癫痫模型组。Western-blot检测结果与免疫组化相同，显示灵芝孢子粉对PTZ致痫模型皮质和海马胶质细胞的增殖活性有抑制作用。中医药治疗癫痫历史悠久，其中灵芝孢子粉具有调节免疫、提高机体耐缺氧能力，稳定膜离子通道，减轻钙超载，对神经系统也有镇静和保护功能，从而激活机体内在的抗损伤机制。综上所述,灵芝孢子粉具有抑制PTZ致痫大鼠模型PCNA表达和胶质细胞增殖活性、减轻痫样发作的程度和抑制痫样放电的作用，但其具体作用机制仍有待进一步研究。灵芝孢子粉的这些作用可能在防治癫痫的发生发展和复发方面具有重要意义。

　　【参考文献】

　　[1]肖波.神经病学[M].第4版.北京:人民卫生出版社,2001,224225

　　[2]张能荣,张秀云.灵芝孢子粉孢子粉中维生素和多糖的分析[J].中国生化药物杂志,1997,18(1):3738

　　[3]陈若云,于德泉.赤芝孢子粉三萜化学成分研究[J].药学报,1991,26(4):267273

　　[4]李虹奇,于德泉,柳雪枚.赤芝孢子粉化学研究[J].中草药,1993,24(10):516

　　[5]江瑞华,李鲁伟,韩世温.灵芝孢子对肿瘤细胞端粒酶的作用[J].齐鲁医学杂志,1999,14(3):168169

　　[6]章灵华,王会贤,于立为.灵芝孢子粉提取物体内外的免疫效应[J].中国免疫学杂志,1994,10(3):169

　　[7]Imai H, Harland J, McCulloch J, et al. Specific expression of the cell cycle regulation proteins, GADD34 and PCNA in the peri-infarct zone after focal cerebrial ischemia in the rat[J].Eur J Neurosci,2002,15(6):1929

　　[8]张树华,朱长庚.氯喹对戊四氮致痫大鼠GFAP、PCNA及CyclinD1变化的影响[J].中华神经医学杂志,2006,5(2):136