厄贝沙坦对早期糖尿病肾病大鼠足细胞nephrin及podocin表达的影响

　　【摘要】 目的：探讨厄贝沙坦对早期糖尿病肾病大鼠足细胞分子 nephrin、podocin mRNA表达的影响。方法：将36只Wistar大鼠随机分为3组:正常对照组(N组)、糖尿病肾病组 (DM组 ) 和厄贝沙坦干预组(E组)。E组大鼠给予厄贝沙坦50mg·kg-1·d-1 灌胃,N组和DM组大鼠给予等量饮用水灌胃。于第8周和第12周检测3组大鼠24h尿蛋白 (Pro) 定量、血清肌酐(Scr)水平;用RT-PCR方法检测肾皮质nephrin、podocin mRNA表达水平。结果：造模后第8周和第12周,DM组大鼠24hPro、Scr水平与N组比较,差别有统计学意义(P<0.01);造模后第8周和第12周,E组大鼠24h Pro与DM组比较,差别有统计学意义(P<0.05);造模后第12周Scr水平与DM组比较,差别有统计学意义(P<0.05)。第8和第12周,DM组大鼠nephrin和podocin mRNA表达水平与 N组比较,差别有统计学意义(P<0.01);E组大鼠nephrin和podocin mRNA表达水平与DM组大鼠比较,差别亦有统计学意义(P<0.05)。结论：厄贝沙坦能通过上调nephrin和 podocin表达水平来改善足细胞功能,减少糖尿病肾病大鼠蛋白尿。

　　【关键词】 糖尿病肾病;厄贝沙坦;nephrin podocin

　　Detection of plasma pentraxin 3 and high sensitivity C-reactive　protein level in patients with primary hypertension and hypertensive heart disease

　　HE Zhaofa,MA Xianhua,MA Yong,ZHANG Chi[JZ)

　　(Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China;Cordiovascular Professional graduate students in graduate school of Jiamusi University,Jiamusi 154007,China;Maternal and child care in the city of Jiamusi,Jiamusi 154002,China)

　　Abstract：Objective：To supply some theoretical evidence for early prevention and treatment of hypertensive heart target organ damage by detecting the level of plasma pentraxin 3 (PTX3) and the level of high sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) in the patients with primary hypertension and hypertensive heart disease.Methods：Fifty patients with essential hypertension who hospitalized at the First Affiliated Hospital of Jiamusi University were divided into hypertension group(n=30)and hypertensive heart disease group(n=20),and 40 healthy individuals were selected as contro1s.The plasma PTX3 and hs-CRP levels in all cases were measured by ELIESA method.Results：The logarithm level of the plasma hs-CRP in the hypertension group was significantly higher than that of the control group and was significantly higher in the hypertensive heart disease group with target organ damage than that of hypertension group and control group(all P<0.01).There was no significant difference in the logarithm level of plasma PTX3 between the hypertension group and the control group(P>0.05)but the logarithm level of plasma PTX3 was significantly higher in the hypertensive heart disease group with target organ damage than that of hypertension group and control group(all P<0.01).Conclusion：The correlation between the plasma PTX3 level and hypertensive heart target organ damage is closer than that between the plasma hs-CRP level and hypertensive heart target organ damage.

　　Key words：Pentraxin 3(PTX3); high sensitivity CRP(hs-CRP); primary hypertension ; hypertensive heart disease ; hypertensive heart target organ damage.

　　近年研究发现,肾小球脏层上皮细胞足细胞在糖病肾病(DN)蛋白尿的发生和发展过程起着重要的作用[1]。本实验通过建立糖尿病肾病大鼠模型 , 观察厄贝沙坦对肾小球足细胞分子nephrin、podocin表达的影响, 探讨厄贝沙坦对早期糖尿病肾病的肾脏保护机制。

　　1 　材料与方法

　　1.1 　实验动物及动物模型制备

　　选择雄性清洁级健康Wistar大鼠 36只 (由佳木斯大学动物实验中心提供)，体重220～260g,随机分成3组:正常对照组(N组)、糖尿病模型组(DM组)、糖尿病模型厄贝沙坦治疗组(E组)。DM组、E组动物腹腔一次性注射链脉佐菌素(STZ，购自sigma公司) 58mg/kg(溶解于新鲜配制的0.1mol/L枸椽酸缓冲液中,pH值为4.5)。于72h后断尾取血后查血糖，大于16.7mmol/L确定糖尿病模型成功。E组同时给予厄贝沙坦(安博维 ,杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司生产)50mg/kg，每日清晨灌胃，共12周。对照组动物仅注射等量枸椽酸缓冲液。整个实验过程未给与降糖药物应用。分别于第8、12周末各组各处死6只大鼠。处死前收集血和尿标本 ，留取肾皮质速冻于液氮中用于RT-PCR检测。

　　1.2 生化检测

　　双缩脉法测定24h尿蛋白定量, ACCU-CHEK血糖仪及其配套试纸检测血糖，全动生化分析仪检测血清肌酐。

　　1.3 RT- PCR肾皮质总RNA提取按Trizol(美国Santa Cruz公司)说明书进行。取2μgRNA进行逆转录合成cDNA。取2μglcDNA作模板,用nephrin、podocin和GAPDH引物行PCR扩增。引物有北京奥科生物技术有限公司合成(1) nephrin:上游TACCACCAGCATTTCCACG3′，下游5′GGGCTCGGCTGTATGTATT3′,产物2 99bp;(2):podocin:上游5′TCAAGCCTCTGGATTTAG3′,下游5′CTTCATGGTGGTTTGCAT3′,产物392bp;(3)GAPDH上游 5′CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT3′，下游5′AGGGGCCATCCACAGTCTTC3′产物596bp。凝胶扫描系统进行阳性条带吸光度积分扫描,以GAPDH条带作为内参照,分别计算nephrin和 podocin基因吸光度 /GAPDH吸光度。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS11.0软件包进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验,方差分析，以P<0.05为有统计学差异。

　　2 结果

　　2.1 　观察指标

　　造模后第8周和第12周,DM组大鼠24h Pro、Scr水平与N组比较,差别有统计学意义(P<0.01);造模后第8周和第12周,E组大鼠24hPro与DM组比较 ,差别有统计学意义(P<0.05),造模后第12周Scr水平与DM组比较,差别有统计学意义(P<0.05),见表1,2。表1 各组大鼠24h尿蛋白排泄量的比较(略)

　　2.2 RT-PCR检测结果

　　造模后第8周和第12周,DM组大鼠nephrin mRNA和podocinmRNA表达水平与N组比较,差别统计学意(P<0.01);E组大鼠nephrinmRNA和podocinmRNA表达水平与DM组大鼠比较 ,差别亦有统计学意义(P<0.05)。见图1，2。

　　3 　讨论

　　蛋白尿的产生与肾小球滤过屏障结构和功能损伤密切相关。肾小球滤过膜由脏层上皮细胞、基底膜和内皮细胞组成;脏层上皮细胞又称足细胞,位于基底膜的外侧,构成防止蛋白丢失的最后一道屏障[2]。足突特异性表达蛋白如nephrin、podocin、CD2相关蛋白(CD2AP)等,是维持肾小球滤过膜结构和功能完整性的重要蛋白[3]。nephrin和 podocin均为跨膜蛋白并特异性表达在裂孔膜上, podocin通过其C末端与nephrin及CD2AP的胞内段相互作用,可促进nephrin诱导的信号传导。研究表明,nephrin-podocin信号传导异常可引起足细胞功能异常并导致蛋白尿的发生[4]。本实验结果显示,糖尿病肾病大鼠模型制备成功后,不仅尿蛋白逐渐增多,而且足突间裂孔膜分子nephrin、podocin mRNA表达水平均下调,其可能原因是糖尿病肾病发生时，高糖导致的 nephrin及podocin表达下调,一方面引起裂孔膜分子的组成发生改变，足突间的分子连接减少或中断,导致足突形态改变而产生蛋白尿; 也有可能是高糖使足突融合甚至消失后,nephrin及 podocin在足细胞表面的分布减少[5],导致蛋白尿排泄增多;另一方面,nephrin及podocin在肾组织表达均下调,使得细胞外到细胞内CD2相关蛋白及细胞骨架蛋白的信号传递发生障碍,足细胞结构进一步破坏,同时足细胞与基底膜相互作用减弱;铆钉于肾小球基底膜的足细胞松动, 甚至从基底膜剥离、脱落,滤过膜的完整性遭到破坏导致蛋白尿产生[5]。另外, 厄贝沙坦作为ARB,除了能够改善糖尿病肾病血流动力学外,还可通过多种途径保护肾功能[5，6]。本研究结果显示, 厄贝沙坦治疗的糖尿病肾病大鼠较未治疗的糖尿病肾病大鼠Scr水平下降，另外还发现厄贝沙坦能使肾组织中nephrin、podocin mRNA水平表达上调,提示厄贝沙坦可能能通过诱导增加nephrin及podocin的表达来改善足细胞的结构而减少尿蛋白排泄,减轻高血糖所致的肾脏损害，nephrin或(和)podocin分子结构上有可能存在血管紧张素Ⅱ受体，其详细作用机制有待进一步研究证明。

　　【参考文献】

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