大鼠急性脊髓损伤热休克蛋白70的表达

　　【关键词】 大鼠 脊髓损伤 HSP70 West-blot免疫印迹

　　Application of propofol and fentanyl combined　with subanesthetic dosage of ketamine in breast surgery

　　YU Zhiyang,XIA Lan,YAN Xiangyong

　　(Department of Anesthesiology, the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001, China; Department of Anesthesiology, the Hospital of Chaihe Forestry Administration, Hailin 157100,China)

　　Abstract：Objective：To investigate the anesthetic effects of propofol (P) and fentanyl (F) combined with subanesthetic dosage of ketamine (K) in breast surgery.Methods：Seventy-five patients,ASA classificationⅠ～Ⅱ, scheduled for breast surgery were included in our study. The patients were randomly divided into 3 groups,Group Ⅰ:P+F;Group Ⅱ:P+K and Group Ⅲ:P+F+K.The induction of anesthesia was achieved by intravenous injection of following anesthetics respectively:propofol (1.5±0.3)mg/kg for each group,2 minutes later,fentanyl 3μg/kg for Group Ⅰ, ketamine 1mg/kg for Group Ⅱand ketamine 0.4mg/kg,and fentanyl 1μg/kg for Group Ⅲ. The maintenance of anesthesia was conducted by continuous infusion of propofol and intermittent injection of fentanyl and/or ketamine.Results:The recovery time of Group Ⅲ was significantly shorter than that of GroupⅡ(P<0.05).The dosage of fentanyl used in the surgery was significantly reduced in GroupⅢ compared to GroupⅡ(P<0.05).Compared to Group Ⅱ,the dosage of ketamine was significantly decreased in Group Ⅲ(P<0.05).However,the incidence of respiratory depression in Group Ⅰ and GroupⅡ was significantly higher than that of Group Ⅲ(P<0.05) and the mean arterial blood pressure of GroupⅡ was significantly higher than that of Group Ⅲ(P<0.05).In Group Ⅱ,the incidence of psychiatric symptoms in the recovery period was significantly higher than that of Group Ⅲ(P<0.05).Conclusion：The recipe of propofol (P) and fentanyl (F) combined with subanesthetic dosage of ketamine (K) in the general anesthesia of breast surgery was more effective and shows few psychiatric symptoms compared with the combination of propofol with fentanyl or ketamine.

　　Key words:propofol;fentanyl;ketamine;total intravenous anesthesia;breast surgery

　　【摘要】目的：观察大鼠急性脊髓损伤后脊髓组织中热休克蛋70的表达。方法：Wistar大鼠56只，随机分成7组，6组制作成急性脊髓损伤模型，另一组作为对照组。分别于伤后2h、6h、12h、24h、48h、72h。建立脊髓损伤动物模型。应用West-blot方法观察各个时段损伤脊髓组织HSP70的表达。结果：急性脊髓损伤后2h,脊髓组织内出现HSP70的表达,损伤后24h脊髓组织中HSP70染色达到高峰,并可维持至损伤后72h。结论：在遭遇损伤性刺激后,脊髓组织HSP70的表达明显增加，表明HSP70有可能在阻止脊髓的继发性损伤方面发挥一定的作用。

　　热休克反应是指生物体受外界刺激后，主动减少正常蛋白基因的表达、启动、产生一组特殊的蛋白质，即热休克蛋白(Heat shock proteins，HSP)。HSP作用是保护机体不受或少受伤害。这种现象最初是由Ritossa在对果蝇唾液腺染色体的研究中发现的。除热以外，多种应激如缺血、缺氧、感染、重金属等都可诱导HSP的表达[1]。HSP70作为其中一种应激蛋白，说明它对生物体的生存有着重要的作用，尤其是应对突发事件。其中HSP70就是其中常见的一类。以前研究多集中在脑组织，对于脊髓损伤报道较少，本实验采用West-blot方法：观察HSP70在损伤脊髓中的表达情况,为进一步了解HSP70在脊髓的二次损伤中的作用提供理论基础。

　　1 材料

　　1.1 实验对象

　　Wistar大鼠56只，雌雄不限，体重(210±10)g(佳木斯大学动物中心提供)，随机分成对照组和损伤组。其中损伤组分为2h、6h、12h、24h、48h、72h组，每组8只大鼠。

　　1.2 主要仪器与试剂

　　①小鼠抗兔HSP70多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司)②羊抗小鼠 IgG(武汉博士德生物工程公司)③低温高速离心机(上海仪表厂)④电泳槽及转移槽(北京六一仪器厂)⑤电热恒温水浴箱(上海仪表厂) ⑥分光光度计(上海机密仪器仪表厂)⑦计算机图像分析系统(苏州仪表仪器有限公司)。

　　1.3 大鼠脊髓损伤模型制备

　　损伤组大鼠用改良Allen法[2]制备大鼠脊髓损伤模型。以3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧固定，背部去毛，常规消毒，铺无菌单，大概在第10胸椎正中切开皮肤皮下，用咬骨钳咬开椎板，暴露脊髓，用重10g、直径2mm的重锤自10cm垂直打击放在脊髓上的圆片，制成大鼠损伤模型，术后肌注青霉素，每8h给大鼠排尿一次。对照组采取相同方法咬开椎板后直接缝合。

　　1.4　标本采集、制备、west-blot免疫印迹测HSP70

　　取不同时间点的大鼠深度麻醉后处死，立即以损伤处为中心取出脊髓，冲洗掉血液，做好标识后马上放入-80℃冰箱保存。做West-blot时每个标本取少量称重匀浆后，裂解30min，离心后取上清，蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳后，制作“凝胶三明治”，将其夹好，安放在电泳槽里，添加转移缓冲液接电后过夜转膜。免疫印迹：把NC膜放在丽春红溶液中染5min，放在脱色摇床上摇。蛋白带出现后，用水冲洗掉未被染上的染液。将NC膜放放在保鲜袋上，可使用自配的脱脂奶粉液体封闭，常温孵育1h。封闭后，使用PBS漂洗多次。将NC膜放进小鼠抗兔HSP70抗体的杂交液中用孵育，TBST在摇床上洗两次，再用TBS洗一次。相同方法在加入酶标记羊抗小鼠IgG，漂洗方法相同。显色：将膜放入DAB显色液中，在常温下用手慢慢摇晃，显色后立即用PBS液冲洗膜，终止反应。扫描仪获取图像。最后图像处理用计算机图像分析系统处理HSP70电泳条带的光密度。

　　1.5 统计学分析

　　采用SPSS11.0统计软件。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，均数间比较采用独立样本t检验。P<0.05判定为差异具有显著性。

　　2 结果

　　对照组脊髓基本没有HSP70表达,或者有很少量表达。脊髓损伤组大鼠在脊髓损伤后2h即有HSP70开始表达，并随着时间增加表达也随之增多，24h表达达到最高峰，维持到72h。之后表达较少，低于6h水平。总之,损伤组HSP70表达较正常组和手术对照组明显增加, 但是对照组也有表达，可能是手术创伤较大，应激反应导致。West-blot免疫印迹结果如图1，定量分析见表1，West-blot结果见表1, (数值越大,HSP 70表达越强)。表1 HSP70 Western-blot扫描定量结果(略)

　　3 讨论

　　HSP70作为一种生物体在应激状态下产生的一种蛋白，有着特殊的作用, 应激状态下能产生应激蛋白几乎存在于整个生物界。HSP70是此类反应蛋白中最常见的一类, 而且在进化上高度保守，说明它对生物体保持应付突发事件有着重要作用和意义。研究发现,在非应激状态下基本没有HSP 70的基础性表达,这与HSP70作为机体的应激反应蛋白的身份是相一致的。但是在本实验的手术对照组中,由于手术操作必然造成大鼠机体一定程度的应激反应也加速损伤细胞的修复，也就造成了有一定量的表达。研究表明，缺血再灌注后HSP70表达30min就出现，消失时间延后[3]，然而严重创伤表达均减少。

　　研究表明，HSP70对细胞保护作用，其诱导的数量与保护作用的强弱呈正相关[4]。从以下机制在中枢神经系统中发挥作用：可作为细胞内的“分子卫士”，通过分子伴侣作用来实现的,它可使蛋白质正确折叠、组装及转位,从而维护细胞功能和维持细胞存活[5]，认识和清除异常蛋白质,促进细胞膜上Na-K-ATP酶活性的修复并加速损害严重且不能修复蛋白的降解;HSP70为修复应激所致细胞损伤所必需。蛋白质合成旺盛，也是与HSP的“分子卫士”作用有关。HSP70还可为细胞色素C传递电子，使其保持还原状态[6]， HSP70还可提高内源性抗过氧化酶如SOD的活力;研究表明在氧化应激等刺激下，通过细胞的信号传递可激活SAPK/JNK3，启动特定程序引发细胞凋亡，同时发现增加细胞HSP70的水平能防止应激诱导的SAPK/JNK3激活，从而减少细胞凋亡;抑制凋亡激活基因p53、Bax的表达及诱导抗凋亡基因BCL-2的表达;HSP70诱导的数量与抗凋亡保护作用的强弱呈正相关[7]。Kitamura等[8]研究发现, c-Jun N-terminal kinase (JNK)信号通路是导致创伤后细胞凋亡的重要途径之一,而HSP70是其中的一种抑制分子; HSP70可以和一些凋亡前效应因子(包括Apaf-1、AIF)和一些信号分子(JNK-1、p53、c-myc)进行中和性的相互作用[7],从而在半胱天冬酶(caspase)和非caspase依赖性的细胞凋亡中通过影响凋亡相关的线粒体事件的上游和下游事件来影响凋亡的发生。通过上述作用机理HSP70在细胞的应激反应中发挥重要的作用。

　　因此,当脊髓遭遇打击损伤后,生物体应激可以产生HSP70,这些HSP70可能通过其中某些机制发挥着其对脊髓神经细胞起保护作用。

　　【参考文献】

　　[1]管华清,顾晓晖,杨惠林,等.热休克蛋白对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用[J].脊柱外科杂志,2004,12(6):363367

　　[2]Allen AR.Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column[J].JAMA,1911,57(10):878880

　　[3]张韬,段志泉,毛羽,等.缺血预处理对犬脊髓损伤及热休克蛋白70表达影响的研究[J].中华外科杂志,2004,42(22):13531356

　　[4]Sale hi AH,Morris SJ,Ho WC,et al.AEG3482 is an anti-apoptotic compound that inhibits Jun kinase activity and cell death through induced expression of heat shock protein70[J].Chem Bio，2006,13(2):213223

　　[5]Bowers DJ,Calvano JE,Alvarez SM,et al.Polymorphisms of heat shock protein-70 (hspa1b and hspa1lLoci) do not influence infection or outcome risk in critically ill surgical patients[J].Shock,2006,25(2):117122

　　[6]Jayakumar J,Suzuki K,Sammut IA,et al.Heat shock protein 70 gene transfection protects Mitochondrial and ventricular function against ischemia-reperfusion injury [J].Circulation,2001,104:13031307

　　[7]屈纪富，史春梦，江德鹏，等.热休克蛋白70在创伤愈合中的作用[J].创伤外科杂志，2006，8(6)：551552

　　[8]Kitamura C,Ogawa Y,Nishihara T,et al.Transient co-localization of c-Jun N-terminal kinase and c-Jun with h shock protein 70 in pulp cells during apoptosis[J].JD Res,2003,82(2):9195