幽门螺杆菌与胃癌 BGC-823细胞凋亡

　　【摘要】 目的研究幽门螺杆菌(Halicobacter pylori ，Hp)在胃癌细胞BGC-823凋亡中的作用及作用机制。方法 将BGC-823 细胞与Hp以不同浓度培养，倒置显微镜观察细胞形态学变化;透射电镜观察细胞凋亡及超微结构变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 与对照组相比，低中浓度Hp作用BGC-823细胞后，倒置显微镜观察到细胞增殖旺盛，并出现明显的凋亡抑制现象;电镜观察到细胞凋亡形态特征及凋亡数目减少。流式细胞仪检测结果: 与对照组相比，中低浓度组凋亡率下降，有显著性差异(P<0.05),高浓度组细胞的凋亡率上升，有显著性差异(P<0.05),以上作用均呈细菌浓度和作用时间依赖性。结论 Hp可抑制胃癌细胞BGC-823凋亡，这可能与凋亡抑制基因上调有关。

　　【关键词】 幽门螺杆菌；胃癌；BGC-823细胞凋亡

　　EFFECTS OF HALICOBACTER PYLORI ONAPOPTOSIS OF HUMAN GASTRICCANCER CELL LINE BGC-823 IN VITRO

　　Zhang Tao，Wang Miaozhou

　　(Department of Digestive Infection ，Qinghai Maternaland Children′s Hospital)

　　Abstract Objective

　　To investigate the effect of Halicobacter pylori (HP) on apoptosis of gastric cancer cell line BGC-823. Methods The BGC-823 cells were co-cultured in different concentration under Halicobacter pylori presenting. Flow cytometric analyses were used for the assessment of apoptosis rates after infection. Cell ultra-structure changes and apoptosis feature were observed by the transmission electron microscope and light microscope. Results Compared with controls， proliferation of cells in the low and middle concentration of Halicobacter pylori groups shown well and the apoptosis was inhibited. pre-apoptosis feature were appeared under transmission electron microscope. assessment of apoptosis rates detected by flow cytometry showed that cell apoptosis rate of the low and middle concentration of Halicobacter pylori groups had a tendency of decreased rates(P﹤0.05).However, in high concentration group, cell apoptosis rates were remarkableincreased(P﹤0.05), apoptosis depends on the time of HP infection and the concentration HP. Conclusion Infection of H. pylori can inhibit apoptosis of gastric cancer cell BGC-823，the mechanisms may be related to up-regulation of apoptosis inhibition gene.

　　Key words Halicobacter pylori Gastric cancer cell line Apoptosis

　　幽门螺旋杆菌(Halicobacter pylori ，Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡的重要病原菌， 其与胃癌及胃黏膜相关性淋巴样组织淋巴瘤的发生密切相关，Hp 感染在幼年时可带菌至成人,自然清除率极低[1]。

　　大量研究资料显示[2]， Hp感染可引发胃黏膜上皮细胞增殖和凋亡的动力学改变， 这可能造成消化系统不同疾病甚至肿瘤的发生。目前认为致病原因可能与Hp自身能分泌毒素(CagA，VacA),代谢产物(脂多糖、氨、一氧化氮等)及诱导热休克蛋白(HSP70 )产生等有关， 另外宿主因素亦很重要，它可影响局部免疫反应过程中释放的细胞因子[3]。本实验将BGC-823 细胞与Hp以不同浓度培养，作用一定时间后，倒置显微镜观察细胞形态学变化;透射电镜观察细胞凋亡及超微结构变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率。探讨不同浓度Hp在胃癌细胞BGC-823凋亡中的作用，并探讨其作用机制， 为Hp相关性胃癌的发生发展提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞系

　　选用人胃癌细胞株BGC-823，由江苏省南通市肿瘤研究所提供。在含10%小牛血清、青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液中行传代培养，当细胞生长活力良好时使用。

　　1.1.2 幽门螺杆菌

　　标准菌株NCTC11637由江苏省南通市肿瘤研究所提供。Hp在含10%卵黄、10%小牛血清、可溶性淀粉、选择性抗生素(万古霉素, TMP,多粘菌素B,两性霉素) 的布氏改良选择性平板培养基上培养，培养72 h后细菌生长活力良好传代，刮取Hp 收集于PBS 中，分光光度计定量， 用含2%小牛血清的RPMI1640 培养液将菌液浓度调成0.2×104 cfu/mL、 3.0×105 cfu/mL、4.5×106cfu/mL 3个浓度。以未加Hp者为对照组。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞凋亡率检测方法

　　流式细胞仪法检测细胞凋亡率。取对数生长期的BGC-823细胞用完全培养液稀释至1×106 个/瓶后接种于细胞培养瓶，待细胞贴壁后,分别给予不同浓度Hp感染。对照组置培养箱中常规培养，24 h后收集上清细胞和贴壁细胞，离心(1000r/min)10 min ，以冷磷酸缓冲液(PBS)冲洗两遍后稀释制成浓度为1×106/mL的细胞悬液，吸取100 μL细胞悬液(含1×105个细胞)至5mL培养管中,加入5μL annexin V-FITC及5M1PI,于室温下避光保存15 min,每管加入400 μL缓冲液混合后上流式细胞仪检测细胞凋亡率并用Cell- QuestTM软件分析。

　　1.2.2 细胞超微结构观察方法

　　收集24 h的各组细胞，离心(1000r/min)10 min，PBS漂洗2次，4%戊二醛预固定，PBS漂洗2次，1%俄酸固定，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，切片，醋酸铀和柠檬酸铅双染色。透射电镜观察细胞超微结构特征。

　　1.2.3 统计学处理方法

　　采用SPSS 13.0统计软件，测定值用x±S表示，进行单因素方差分析,组间比较用LSD法检验。以P < 0.05者为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 倒置显微镜观察结果

　　BGC-823细胞过夜后显现为细胞有脱壁现象，部分呈类圆形，随时间延长，贴壁细胞内出现较多中毒颗粒， 细胞表现空泡样病变。加入Hp共同培养的中低浓度组细胞单独生长良好，呈梭形，细胞轮廓清楚，细胞间接触紧密，细胞生长旺盛。24 h后高浓度组培养液中可见细胞崩解后的残留颗粒或菌体。细胞周围出现碎片，部分细胞死亡后漂浮在培养液中(图1～2)。

　　2.2 透射电镜观察细胞超微结构的改变情形

　　未感染Hp 的胃癌细胞BGC-823 呈退行性改变：细胞核异染色质增多，呈团快状，线粒体肿胀、呈空泡状，内质网扩张。在Hp与细胞共育24 h后，低浓度组可见细胞核大，核仁清楚，染色质丰富(部分分裂)，细胞器结构正常，细胞膜完整。共育48 h后，各浓度组均可观察到细胞表面微绒毛消失、细胞出现空泡样病变及细胞核裂解为碎块现象， 核膜处出现染色质边集现象， 可见新月形形成，呈现典型早期细胞凋亡改变( 图3～4)。

　　2.3 细胞凋亡率结果

　　不同浓度Hp与细胞共同培养24 h、48 h后，与对照组相比，中低浓度组凋亡率下降，有显著性差异(P<0.05),高浓度组凋亡率上升，有显著性差异(P<0.05),以上作用均呈细菌浓度和作用时间依赖性。详细结果见表1。表1胃癌BGC-823细胞感染Hp后不同时间凋亡率(x±S)注：与对照组相比* P < 0.05 ，与低浓度相比# P<0.05，与24h相比* P<0.05.

　　3 讨论

　　1994 年Hp被列为胃癌的Ⅰ类致癌原[4]。研究表明[5，6]，Hp菌体成分或其诱导的炎症反应，导致细胞增殖与凋亡之间的动态平衡被破坏，使上皮细胞增生加速且同时凋亡被抑制。杨艺等[7]报告，Hp可能同时具有与细胞增殖和凋亡相关的两类因子，当低浓度Hp作用于细胞时，Hp的促细胞增殖因子发挥作用， 而促细胞凋亡相关因子的作用被细胞的代偿机制所对抗,表现为胃上皮细胞过度生长增殖;当高浓度时，Hp的促细胞凋亡作用和致细胞空泡毒作用则占优势,可使胃黏膜出现损伤,这与本研究结果一致。

　　本研究结果提示,Hp可能是以不同因子诱导细胞增殖与凋亡的。在中低浓度组，细胞凋亡率下降可能主要是菌体成分诱导的炎症反应，导致细胞增殖与凋亡之间的动态平衡破坏，凋亡抑制基因上调，胃癌细胞增生加速，凋亡抑制。本实验细胞凋亡率随浓度不同而出现的变化提示，浓度不同可能启动不同的凋亡途径。据研究，Hp与AGS细胞在体外孵育后发现，Ki-67阳性率显著提高，细胞增殖旺盛。因本实验未测定细胞增殖相关指标，无法了解凋亡抑制时细胞增殖情况，初步推断低中浓度组细胞增殖加速。

　　宣兰兰[8]研究发现，HP-L型感染的BGC-823细胞中，凋亡抑制蛋白Livin，bcl-2及P53表达的阳性率随着细菌比例的增加及培养时间的延长逐渐增加，各组间差异亦具有统计学意义。提示HP-L型能抑制BGC-823细胞的凋亡，本实验中低浓度组实验结果与此一致。研究表明[9]，CagA+Hp 感染可诱导胃黏膜上皮细胞凋亡。通过Hp菌株感染体外培养胃腺癌细胞株SGC-7901 同样观察到感染细胞出现凋亡现象，并认为Hp诱导胃黏膜上皮细胞凋亡可能主要通过线粒体途径。Manente L等[10]报道Hp-VacA 蛋白有直接致体外培养胃黏膜上皮细胞凋亡的作用，Hp 很可能通过促进细胞凋亡干扰胃黏膜细胞增殖与凋亡的动态平衡参与了胃癌的发生与发展。

　　综上所述，本实验从细胞凋亡的角度探讨了Hp了感染与胃癌细胞凋亡的关系，Hp 能抑制BGC-823细胞凋亡，但有细菌浓度的限制并有时间依赖性，其作用机制可能是通过上调凋亡抑制基因及抑癌基因表达的失调来实现的。本试验为明晰Hp相关性胃癌的发生机制提供了实验依据。当然，Hp相关性疾病是多因素作用的结果，选择更为合适的Hp细菌浓度，及其寻找与胃癌细胞凋亡、增殖有关的基因，将是我们课题下一步拟解决的问题。

　　【参考文献】

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　　[4]Fan XG， Kelleher D， Fan XI， et al . Helicobacter pylori increases proliferation of gastric epithelial cells[J].Gut， 1996，38：19-20

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　　[7]杨艺 邓长生，姚学军，等. 幽门螺杆菌对胃上皮细胞系列SGC-7901 细胞生长的影响[J].中华消化杂志， 2001， 21 (2)：113-115

　　[8]宣兰兰， 于东红， 承泽农，等 幽门螺杆菌L抑制胃癌细胞凋亡的实验研究[J].癌变·畸变突变 ，2009， 21 (2)：93-97

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　　[10]Manente L， Perna A， Buommino E， et al. Th Helicobater pylori’sprotein VacA has direct effect on the regulation of cell cycle and apoptosis in gastric epithelial cells[J].Cell Physiol， 2008，214 (3)： 582-587