L.casei Zhang PG对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

　　【摘要】 目的观察干酪乳杆菌(L.casei Zhang)肽聚糖( peptidoglycan, PG)对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数及巨噬细胞表面C3b受体的影响。方法应用酵母菌体外吞噬法观察巨噬细胞的吞噬功能 ;应用伊红染色法计数酵母细胞花环(Yc-花环)形成率;应用动物实验法进行小鼠毒性试验。结果 L.casei Zhang PG组腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数分别为 67.69±7.08和 2.11±0.39,明显高于对照组的31.22±4.18和 0.78±0.14, 差异有显著性。L.casei Zhang PG组巨噬细胞表面Yc-花环形成率为60.01±4.02，明显高于对照组的35.07±5.71，差异有显著性。毒性试验结果显示，连续观察一周L.casei Zhang PG组小鼠，小鼠均无耸毛、消瘦或食欲不振等中毒现象。结论 L.casei Zhang PG对巨噬细胞有一定的激活作用，能提高其吞噬功能，且安全可靠。

　　【关键词】 干酪乳杆菌 肽聚糖 巨噬细胞 C3b受体

　　EFFECT OF L.CASEI ZHANG PEPIDOGLYCANON PHAGOCYTOSIS OF MICROPHAGE IN MICE

　　Shuang Jie1, Yong Sheng1, Zhang Qijin2

　　(1. Dept. of pathogen biology, Qinghai University Medical School;

　　2. College of Veterinary Science and Medicine, Inner Mongolia Agricultural University )

　　Abstract Objective

　　To investigate the effects of L.casei Zhang peptidoglycan on the phagocytosis rate, phagocytosis index and surface C3b receptor of microphage in mice. Methods The phagocytic function of microphage was detected by yeast in vitro; the yeast rosette (Yc rosette) forming rate was detected by eosin staining; the toxicity of L.casei Zhang peptidoglycan on animal was tested in mice. Results The phagocytosis rate and index of peritoneal microphage stimulated by L.casei Zhang peptidoglycan were 67.69±7.08 and 2.11±0.39, respectively and significantly higher than those in control (31.22±4.18 and 0.78±0.14). The Yc rosette formation in surface of macrophage in L.casei Zhang peptidoglycan group was 60.01±4.02, significantly higher than that of control group (35.07±5.71), and showed statistical differences. The toxicity test showed that there re no signs such as setting up the wool, becoming emaciated and having a delicate appetite, etc. and all of them survived. Conclusion L.casei Zhang peptidoglycan can activate the microph ing. age and promote the function of its phagocytosis and safe for us.

　　Key words L.casei Zhang Peptidoglycan Microphage C3b recoptor

　　大量研究表明，益生菌具有免疫调节作用。干酪乳杆菌(L.casei Zhang)是一种重要的益生菌,其对机体的有益作用包括生物拮抗、营养作用、免疫调节和抗衰老作用等。人体内一定数量的干酪乳杆菌对维持肠道的微生态平衡及机体的健康起重要作用[1]。肽聚糖( peptidoglycan, PG)是干酪乳杆菌细胞壁的主要成分，具有多种生物活性, 是乳酸菌和宿主相互作用的重要分子[2]。L.casei Zhang是从内蒙古酸马奶中分离到的，具有耐胆盐和耐酸生长特性和抗感染特性[3]。本研究以腹腔注射L.caise Zhang PG的方式刺激小鼠巨噬细胞，观察其对巨噬细胞吞噬功能的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 试验动物与饲料

　　昆明系小白鼠共60只，雌雄各半。体重约18～22g，颗粒饲料喂养。购自内蒙古大学试验动物研究中心。

　　1.1.2 菌种

　　干酪乳杆菌、酵母菌由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 L.casei Zhang PG的制备

　　将L.casei Zhang菌种在脱脂乳培养基中活化后接种于MRS培养液中增菌培养(37℃，48h)，离心(2000rpm，10min)收集菌体;将菌体悬浮于蒸馏水中，超声处理(20min，3次)，上清液差速离心(1000rpm，15min;10000rpm，20min)收集粗细胞壁;取适量粗细胞壁加SDS溶液离心(10000rpm，20min)，收集粗肽聚糖;将粗肽聚糖洗净后溶于胰蛋白酶缓冲液(pH 7.5)中，37 ℃水浴振荡20 h，离心(10000rpm，20min)获得酶处理粗细胞壁，粗细胞壁用无水乙醇脱水;最后悬浮在三氯乙酸溶液(10g/dL)中去除共价结合的磷壁酸，离心(10000rpm，20min)后将沉淀物用蒸馏水洗涤、用无水乙醇脱水干燥，保存。具体步骤见参考文献[4] 。

　　1.2.2 试验分组及剂量

　　试验动物分对照组和实验组(各10只小鼠)。对照组腹腔注射生理盐水

　　(0.5mL/只)，实验组腹腔注射L.casei Zhang PG (0.5 mL/只，1 mg/mL)，连续两天。到第五天分别测定巨噬细胞吞噬率、吞噬指数和酵母细胞花环(Yc)形成率。

　　1.2.3 小鼠巨噬细胞吞噬试验

　　实验组小鼠腹腔注射L.casei Zhang PG后第5天，给小鼠腹腔注射灌洗液(2mL/只)，取腹腔巨噬细胞进行吞噬试验(吞噬物酵母菌用生理盐水配浓度至8×107 个/mL)，用油镜观察巨噬细胞吞噬酵母菌现象[5]。

　　1.2.4 巨噬细胞表面C3b受体的检测

　　1.2.4.1 酵母菌的处理：将酵母菌接种于MRS培养基上(37℃，24h)，离心(1500rpm，5min)收集菌体，用灭菌蒸馏水洗涤后用100 mL乙醚酒精(乙醚:酒精=1:1)浸泡15 min除去油脂，洗净、离心，取沉淀物用200 mL蒸馏水配成悬液，煮沸15 min，趁热离心，弃上清液，洗净沉淀物，用无水乙醇脱水，60 ℃烘干，备用。

　　1.2.4.2 补体的制备：取正常小鼠新鲜血清加入酵母干粉(2mg/mL)，放置(4℃)15 min，籍以吸收可能存在的特异性IgG。分装，冷冻备用。

　　1.2.4.3 单层巨噬细胞的制备：将被L.casei Zhang PG刺激后的小鼠，用含肝素、钙镁巴比妥缓冲液(5mL/只)冲洗小鼠腹腔，将收集到的腹腔细胞悬液(0.5mL)滴加于干净的载玻片上，平置(37℃)2 h，然后用Hanks液轻洗玻片去除非黏附细胞。此过程中玻片须保持湿润，以免细胞死亡。

　　1.2.4.4 酵母菌-C3b复合物制备：将血清用巴比妥缓冲液(血清:巴比妥缓冲液=1:20)稀释后，加入酵母菌干粉(5mg/mL)混匀、温育(37℃，1 h)，离心弃上清液，沉淀物用缓冲液洗涤两次后恢复原量，即为Yc悬液。

　　1.2.4.5 Yc-花环试验方法：将Yc悬液滴加于单层巨噬细胞上，平置(4℃)1 h，继用缓冲液冲洗玻片，至无酵母颗粒冲下为止。加2%戊二醛固定、HE染色后，用显微镜计数细胞。以一个巨噬细胞周围附有6个或6个以上酵母菌者计作一个花环，随机观察200个巨噬细胞，计算花环形成率。

　　1.2.5 实验组小鼠急性毒性试验

　　以每只1、2、4 mg三个梯度剂量的L.casei Zhang PG对小鼠行腹腔注射，每个剂量组注射6只小鼠，观察1周。

　　1.2.6 统计学处理方法

　　采用SPSS11.0软件对各试验数据进行处理，结果以x±S

　　表示，两组间比较采用独立样本t检验、方差分析，显著性检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 L.casei Zhang PG对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

　　实验组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率与对照组相比存在显著差异(P<0.05);实验组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数与对照组相比存在显著差异(P<0.05)，见表1。表1L.casei Zhang PG对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响(x±S)

　　镜检可见实验组小鼠腹腔巨噬细胞体积较大，表面突起增多而延伸。相同条件下，每个巨噬细胞吞噬的酵母菌数较对照组多，见图1～2。

　　图1 对照组巨噬细胞吞噬图(100×) 图2 实验组巨噬细胞吞噬图(100×)

　　2.2 L.casei Zhang PG对巨噬细胞表面C3b受体的影响

　　实验组小鼠腹腔巨噬细胞表面Yc-花环形成率显著高于对照组(P<0.05) ，见表2。表2L.casei Zhang PG对小鼠巨噬细胞表面C3b受体的影响

　　镜检可见试验组小鼠腹腔巨噬细胞体积变大，表面突起增多而延伸。相同条件下，每个巨噬细胞粘附的酵母菌数较对照组多，见图3～4。

　　图3 对照组Yc-花环形成图(100×) 图4 实验组Yc-花环形成图(100×)

　　2.3 L.casei Zhang PG毒性试验结果

　　连续观察1周，试验组小鼠无耸毛、消瘦或食欲不振等中毒现象。只有高剂量组(4mg)有1只小鼠注射部位皮肤有红肿现象，3天后消失，其他没有异常反应。

　　3 讨论

　　巨噬细胞是在种系进化过程中出现较早的免疫细胞，作为一种非常活跃的非特异性防御细胞，具有多功能的免疫效应，不仅能作为抗原递呈细胞在机体免疫的前期阶段起作用，而且能通过吞噬细胞直接发挥免疫效应，或通过分泌多种生物活性物质而起间接作用[7]。在正常条件下，巨噬细胞对外来病菌及体内的肿瘤细胞有杀伤作用，被激活后许多形态、代谢功能随之变化。吞噬率和吞噬指数可反映巨噬细胞吞噬功能的变化。本实验用小鼠作为研究对象，发现从L.casei Zhang中提取的PG给小鼠腹腔注射可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数;显微镜下观察，实验组小鼠腹腔巨噬细胞体积变大。实验结果表明，腹腔注射L.casei Zhang PG可促进巨噬细胞的吞噬功能，提高机体的免疫力。

　　单核巨噬细胞表面并存Fc受体和C3b受体，他们在巨噬细胞识别、结合、吞噬抗原颗粒及传递抗原信息中起着协同作用。在巨噬细胞处于激活状态下，C3b受体与C3b包被颗粒结合打开了介导内吞的活化枢纽。巨噬细胞C3b受体可随机体的不同免疫状态而发生变化，C3b受体的检测可作为衡量巨噬细胞功能的标志之一。Yc-花环试验结果表明，实验组小鼠腹腔巨噬细胞表面C3b受体活性增强，Yc-花环形成率较对照组有明显提高;镜检可见实验组巨噬细胞体积变大，表面突起增多而延伸，相同条件下，每个巨噬细胞黏附的酵母菌数也较对照组多。从毒性试验结果看，各剂量组小鼠均无中毒现象，说明其安全性好、毒副作用小。

　　【参考文献】

　　[1] 苏广伟，孙进，施用晖.乳酸杆菌肽聚糖对小鼠机体免疫功能的调节作用[J].中国生物工程杂志， 2006，8( 19)：67-70

　　[2] 余叶红，郭本恒.干酪乳杆菌LC2W细胞壁组分对RAW264.7巨噬细胞吞噬活性的影响[J]. 2009，1(1)：98-100

　　[3] CloudHansen KA, Peterson SB, Stabb EV, et al. Breaching the great wall: peptidoglycan and microbial interactions[J]. Nat Rev Micro, 2006, 4(9): 710-716

　　[4] 马西艺，乐国伟.乳酸杆菌肽聚糖的分离鉴定及其免疫活性[J].食品与生物技术，2003，6(12)：67-69

　　[5] 孟凡伦， 马桂荣.乳链球菌SB900胞壁肽聚糖的部分生物学活性[J].微生物学报，1998，38(5)：376-380

　　[6] 孟和毕力格，乌日娜，王立平，等.不同地区酸马奶中乳杆菌的分离极其生物学特性的研究[J]，中国乳品工业，2004，32(11)：6-11

　　[7] 徐杰，邵亚东，孟和毕力格.蒙古族传统酸马奶中嗜酸乳杆菌发酵特性研究[J].乳业科学与技术，2005