清热解毒、化瘀通络方对系膜增生性肾炎大鼠肾组织肿瘤坏死因子α、内皮素1的影响

　　【摘要】 目的 观察清热解毒、化瘀通络全方及其拆方组对系膜增生性肾炎大鼠肾组织肿瘤坏死因子α(TNFα)、内皮素1(ET1)的影响，以探讨清热解毒、化瘀通络全方及其拆方的作用环节。方法 本实验以雄性SD大鼠为研究对象，以隔日牛血清白蛋白灌胃并尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B及皮下分点注射完全氟氏佐剂和不完全氟氏佐剂的方法复制系膜增生性肾炎模型。观察各组实验大鼠肾小球细胞外基质增生情况;免疫组织化学法检测肾组织中TNFα及ET1的表达并进行半定量分析。结果 复制系膜增生性肾炎动物模型，光镜下肾小球轻中度系膜增生。模型组和各观察组系膜增生性肾炎实验大鼠肾组织TNFα，ET1表达均有显著增高(P<0.01);在降低肾组织TNFα和ET1表达方面，全方组能显著降低两者的表达水平(P<0.01)，两个拆方组各有侧重，清热解毒组偏重于降低肾组织TNFα表达，而化瘀通络组偏重于降低肾组织ET1表达。结论 清热解毒、化瘀通络多法合用在系膜增生性肾小球肾炎的治疗中较单一疗法更为有效，可从不同作用环节减轻肾脏病理损伤。

　　【关键词】 肾小球肾炎中医药疗法; 系膜增生; 肿瘤坏死因子α; 内皮素1; 大鼠; 动物，实验

　　The effect of prescriptions of Qingre Jiedu and Huayu Tongluo on TNFα and ET1 in MsPGN model rats YUN Ying，CAO Guanghai.Department of Pediatrics,Fuxing Hospital,Capital Medical University,Beijing 100045，China

　　【Abstract】 Objective Observe the effects on TNFα and ET1 expression in renal tissues of rats with mesangial proliferative glomerulonephritis(MsPGN) by Chinese herbs with functions of both the heatclearing and detoxification(HD,Qingre Jiedu),and the removing of blood stasis and channel obstruction(RBSCO,Huayu Tongluo),or each of them,in order to explore mechanism of the Chinese herbs.Methods Male SD rats were included as the study object.The rat models of MsPGN were made by taking orally and timecontrolled vein injecting boving serum albumin(BSA),and vein injecting staphylococcus enterotoxin B(SEB),and spot of division of hypodermic injecting complete Freund's adjuvant and not complete Freund's adjuvant.The proliferation of glomerular mesangial cell(MC) and glomerular extracellular matrix(ECM) was studied by light microscope on rat models of MsPGN,who were treated by combined HD with RBSCO,and by HD,or by RBSCO，respectively.TNFα and ET1 expression in renal tissues was detected by immunohistochemical method,and quantitative analysis was made.Results In the successful mesangial proliferative nephritis models,glomerular mesangial proliferation was mild to moderate,and TNFα and ET1 expression in renal tissues increased significantly(P<0.01).The treatment of combination of HD with RBSCO could significantly reduce TNFα and ET1 expression levels in the renal tissues.HD or RBSCO respectively might have different action mechanism,because HD group was emphased on reducing TNFα expression(P<0.01),while RBSCO Group was emphased on reducing ET1 expression(P<0.01).Conclusions The treatment of combination of HD with RBSCO for MsPGN is more effective than that of single HD or RBSCO,and it can reduce the renal pathological damage through different treatment mechanisms.

　　【Keywords】 MsPGN/The therapy of TCM; Mesangial proliferative; TNFα; ET1; Rat; Animal，experiment

　　系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis,MsPGN)是国内儿童肾小球疾病最常见的病理类型之一[1]。近年来，从毒邪、瘀血角度论治MsPGN取得一定的进展[2]，本文对临床中毒瘀伤络型儿童肾炎常用的清热解毒、化瘀通络方药进行研究，探讨全方及其拆方对MsPGN模型大鼠肾组织肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNFα)及内皮素1(endothelin，ET1)水平的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 普通级雄性SD大鼠40只，体质量(100±20)g。购于河南省实验动物中心，批号：20080910，在河南中医学院动物实验中心饲养。

　　1.2 试剂与药品 葡萄球菌肠毒素B(北京军事科学院微生物研究所，批号：080912);牛血清白蛋白(上海化学试剂公司分装厂，批号：20060112);完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂(SIGMA公司，批号：107K8618,068K8761);TNFα，ET1免疫组织化学试剂盒(博士德生物技术有限公司，批号：200801228，200801228)。清热解毒、化瘀通络全方组由黄芩、连翘、牛蒡子、生地、赤芍、川芎等组成(江阴天江药业有限公司，批号：0808118);清热解毒组药物有黄芩、连翘、牛蒡子等;化瘀通络组药物有生地、赤芍、川芎等。

　　1.3 实验仪器 超薄切片机(德国,LEICA RM2245型);光学显微镜(OlympusCX441型);病理图像系统(同济医科大学千屏影像公司,HPIAS1000)。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 动物分组 实验动物适应性喂养1周，饮食、精神状态正常，选取尿蛋白定性和尿红细胞均为阴性者作为研究对象，40只大鼠按随机数字表法分为5组：空白组、模型组、全方组、清热解毒组、化瘀通络组，每组8只。

　　1.4.2 MsPGN模型大鼠制备 参照刘震等[3]报道的方法加以改进，实验共8周，自实验的第1天起，以牛血清白蛋白20 mg(配成水溶液)隔日灌胃1次，直至实验结束。实验第1天经皮下分点注射完全弗氏佐剂0.2 mL(含牛血清白蛋白2 mg)，实验第8天经皮下分点注射不完全弗氏佐剂0.2 mL(含牛血清白蛋白2 mg);实验第8天和第15天分别从尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B 0.4 mg/kg(配成水溶液)各1次。

　　1.4.3 给药方法 空白组：正常饲养并给予相等剂量的生理盐水灌胃;模型组：除造模外给予和观察组相等剂量的生理盐水灌胃;全方组、清热解毒组、化瘀通络组分别按生药34.00，12.50，20.75 g/(kg·d)配成水溶液灌胃给药，每日1次。以上各组均自由饮食，各观察组从造模第1天起给药(剂量按照成人用量的15倍换算)，直至实验结束，共8周。

　　1.4.4 实验方法 实验第8周末，麻醉后处死大鼠，迅速取双侧肾组织，常规10%甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸石蜡，石蜡包埋后切成2～3 μm厚的切片，分别进行苏木精伊红(HE)染色，观察肾组织形态学变化;肾组织TNFα，ET1免疫组织化学测定，采用HPIAS1000病理图像分析系统分析免疫组织化学切片。在400倍光镜下测量每个肾小球中着色的系膜基质的面积及整个肾小球的面积，以二者的比值表示该种成分在肾小球系膜基质中的相对含量，每个标本取6个肾小球取平均值。

　　1.5 观察指标 光学显微镜下观察HE染色大鼠肾组织形态学变化;免疫组织化学检测大鼠肾组织TNFα，ET1在肾小球的表达。

　　1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，计量资料用±s表示，组间差异性比较采用单因素方差分析，方差齐时用LSD法，方差不齐时用DunnettT3检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 实验大鼠的一般情况 模型大鼠于造模后均有不同程度的精神不振、饮食减少、皮毛蓬乱，部分出现腹泻，但能于2～3 d自行缓解。5只大鼠死亡，模型组大鼠死亡2只，全方组、清热解毒组、化瘀通络组各死亡1只。其中全方组死亡大鼠为灌胃不当致死，其他均为严重腹泻致死。

　　2.2 清热解毒、化瘀通络全方及其拆方对大鼠肾脏病理的影响

　　2.2.1 大鼠肾组织病理 光镜下HE染色见模型组肾小球系膜组织增生，以肾小球系膜细胞及细胞外基质中度增生为主。增生的系膜宽度超过毛细血管的直径，部分肾小球球囊变窄，毛细血管管腔呈轻度的挤压现象。部分大鼠系膜增生程度较轻。肾小球基底膜正常，肾间质血管周围有炎性细胞浸润;全方组肾小球结构多为正常，部分大鼠肾小球呈轻度系膜组织增生，以肾小球系膜细胞增生为主，增生的系膜宽度不超过毛细血管的直径，毛细血管管腔未见到挤压现象。两个拆方组肾小球呈轻、中度系膜增生;部分大鼠增生的系膜宽度超过毛细血管的直径，毛细血管管腔呈轻重不等的挤压现象。

　　2.2.2 免疫组织化学测定大鼠肾组织TNFα，ET1在肾小球的表达 TNFα，ET1阳性反应物呈棕黄色颗粒，病理图像分析，依颗粒多少及染色深浅判定阳性强度。TNFα于空白组肾小球中呈弱阳性。模型组切片中阳性明显，阳性颗粒见于肾小球系膜区，且阳性染色强度与HE染色显示的病变程度一致。ET1分布于各组大鼠肾组织中，在空白组大鼠肾组织中均呈弥漫分布，染色较浅，为弱阳性，较均匀一致;模型组的ET1阳性表达明显增强，血管平滑肌细胞、肾小球内皮细胞和肾小球系膜细胞均呈强阳性，部分刷状缘阳性反应颗粒密集呈腔缘性分布。各组大鼠肾组织TNFα和ET1在肾小球的表达结果见表1。表1 各组大鼠肾组织TNFα，ET1水平的比较(±s,%)注：与空白组比较，aP<0.01;与模型组比较，bP<0.05，cP<0.01;与全方组比较，dP<0.01;与清热解毒组比较，eP<0.05。

　　由表1可知，各造模组肾小球TNFα表达水平均有显著增高(P<0.01);与模型组比较，全方组和清热解毒组均显著降低(P<0.01)。各造模组肾组织ET1表达水平均有显著增高(P<0.01);与模型组比较，全方组、化瘀通络组和清热解毒组均降低，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，说明在降低肾小球ET1表达方面，各观察组都有一定作用，三组之间差异无统计学意义，但从其均数来看全方组优于化瘀通络组、清热解毒组。

　　3 讨论

　　TNFα为一种公认的最重要的炎症细胞因子，ET与肾小球系膜细胞分裂、增生有关，二者在MsPGN的发病机制和病变过程中起着极其重要的作用[4]。TNFα与肾炎发病关系密切，在发病机制中作为重要递质起作用，TNFα是炎症介质连锁反应中启动最早的因子[5]，还可引起肾小球内皮细胞表达促凝血因子、黏附分子，促进肾小球系膜细胞、内皮细胞及血管平滑肌细胞增生，使肾小球基底膜通透性增加。其对肾小球的损害主要通过影响肾小球血流动力学、凝血纤溶平衡及炎性细胞向肾小球浸润完成[6]。研究发现，免疫复合物沉积等多种因素作用肾小球系膜细胞，刺激其分裂增生，合成TNFα。在病变早期由于刺激因素弱，肾小球系膜细胞的增生程度及TNFα的产生量都较少，随着病情的恶化及刺激因素的增多，肾小球系膜细胞不断增生，合成TNFα的功能亦增强，使TNFα水平增高[7]。ET1对肾脏血流动力学的影响引起肾脏血管强烈收缩，肾血流量减少，肾小球滤过率下降，从而加重肾损害引起高血压[8];ET1促进肾小球系膜细胞和细胞外基质增生和聚积：ET通过自分泌和旁分泌的方式介导多种细胞因子而促进肾小球系膜细胞增生和细胞外基质形成。在MsPGN中，ET1可刺激肾小球系膜细胞的DNA合成，上调肾小球系膜细胞表达TNFα、血管细胞黏附分子1和细胞间黏附分子1，促使肾小球系膜细胞增生。当受到多种炎症损害时，肾小球系膜细胞、肾血管内皮细胞乃至上皮细胞均增加ET1表达及分泌。肾小球损伤时，多种相关细胞因子反应性增高，促进肾小球系膜细胞释放ET1增加[9]。

　　中医古籍中虽无MsPGN的名称，但从MsPGN发病过程和临床表现分析，本病可属于中医“尿血”“水肿”等范畴。多数学者认为本虚标实、虚实夹杂是本病的病机。《内经》曰：“邪之所凑，其气必虚”“正气存内，邪不可干”。因此，MsPGN是在脏腑亏虚，正气不足的基础上，遭受外邪或内伤因素，导致脏腑功能损伤，病理产物生成，产生本虚标实的病机特点。但临床中尚有部分患儿，病初以风为先导从口鼻而入，客于咽喉;病程中常因外感风热、热毒侵袭，血尿、蛋白尿反复出现或经久不消，单纯益气养阴、健脾补肾不能减轻症状。根据祖国医学理论，结合多年临床经验，此类患儿病初常因热毒客于咽喉，侵犯于肺，因肺为水之上源，毒邪犯肺，上源不清，水道不利，则膀胱水府不净，热伤血络而尿血;蛋白为人体精微物质，“肾为封藏之本”，肾络损伤，精微外泄而见蛋白尿。故重视解毒清上，化瘀通络，从祛邪论治。

　　正常情况下肾组织TNFα，ET1表达较少，而造模后模型组和各观察组均有增高，证明TNFα和ET1参与了MsPGN的发生;在降低肾组织TNFα表达方面，清热解毒、化瘀通络全方组肾组织TNFα相对含量较模型组显著减少(P<0.01)，拆方组中清热解毒组作用优于化瘀通络组。在降低肾组织ET1表达方面，各观察组都有一定作用，但差异无统计学意义，但从其均数来看全方组优于化瘀通络组、清热解毒组。提示全方组能降低TNFα和ET1在肾组织的表达，从而减轻炎症反应，改善肾脏微循环，纠正高凝状态，增加纤维蛋白活性，减轻血小板凝集，有助于免疫复合物的清除和增生性病变的转化和吸收，减少肾小球系膜细胞增生及细胞外基质积聚;化瘀通络组在降TNFα方面较弱，对降低ET1在肾组织的表达较强;而清热解毒组对TNFα和ET1都有作用，只不过在降低ET1在肾组织的表达方面要弱于化瘀通络组。

　　上述结果表明，肾小球炎症反应时，虽然活血化瘀药有一定的抗炎作用，但其力不及清热解毒药力强，提示清除炎症介质和炎症反应的必要性，推测清热解毒药物能提高化瘀通络药的效果;而在抑制异常增高的ET1环节，化瘀通络药物优于清热解毒方药，两者合方从不同环节作用，起到良好的治疗效果，进一步证明了全方组优于拆方组。本实验仅从一个侧面探讨清热解毒、化瘀通络方对MsPGN大鼠的可能作用环节，详细机制有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] 刘树军，李殿秋，丁亚杰，等.小儿肾小球疾病肾活检病理诊断价值[J].中国实验诊断学，2007，11(3):340341.

　　[2] 朱辟疆，解冰,江丽萍.肾炎康对系膜增生性肾炎大鼠肿瘤坏死因子α和内皮素1的影响[J].中国中西医结合急救杂志，2006,13(3):150152.

　　[3] 刘震，周树录，谭建三，等.大鼠系膜增殖型肾小球肾炎模型的改进[J].华西医科大学学报,1996，27(2)：182184.

　　[4] 颜晓勇，曾远扬，李琮辉.慢性肾小球肾炎患者血浆内皮素1的变化及临床意义[J].遵义医学院学报，2004，27(5)：456458.

　　[5] 夏艳斌,高昕媛.1型糖尿病患儿血清肿瘤坏死因子α检测及其与尿白蛋白的关系[J].牡丹江医学院学报,2007,28(4):4849.

　　[6] Sabry A，Sheashaa H，ELHUSSEINI A，et al.Proinflammatory cytokines(TNFalpha and IL6) in Egyptian patients with SLE：its correlation with disease activity[J].Cytokine，2006，35(34)：148153.

　　[7] 熊传银.系膜增生性肾小球肾炎TNFα、IL6水平的变化及意义[J].热带医学杂志，2007，7(6)：569571.

　　[8] Kurata H，Takaoka M，Kubo Y，et al.Protective effect of nitric oxide on ischemia/reperfusioninduced renal injury and endothelinl overproduction[J].Eur J Pharmacol，2005，517(3)：232239.

　　[9] Kuo HT，Shin SJ，Kuo MC，et al.Effects of specific endothelin1 receptor antagonists on proliferation and fibronectin production of glomerular mesangial cells stimulated with angiotensinⅡ[J].Kaohsiung J Med Sci,2006，22(8)：371376.