绵马贯众水和乙醇提取物抗病毒的实验研究

　　作者：孙科峰，于艳，李丽静，张哲，邓莉，李春霞，杨关林 作者单位：辽宁省教育厅创新团队项目(2006T096) 110032 沈阳，辽宁中医药大学附属医院中医药实验中心(孙科峰，于艳)，心血管内科(张哲，邓莉，李春霞，杨关林);130117 长春，长春中医药大学中药药理教研室(李丽静)

　　【摘要】 目的 观察绵马贯众水、乙醇两种提取物的抗病毒作用。方法 (1)离体实验：采用致细胞病变法观察绵马贯众水、乙醇两种提取物对流感病毒(FM1株)、呼吸道合胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ型、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)的抑制作用，计算药物半数有效浓度(EC50)、治疗指数(TI);(2)在体实验：绵马贯众提取物按25%、12.5%、6.25%原液的浓度设高、中、低3个剂量给药，并设立正常对照组和病毒对照组，观察绵马贯众水、乙醇两种提取物对滴鼻感染FM1株流感病毒的昆明种小鼠肺指数的影响。结果 绵马贯众水、乙醇两种提取物对流感病毒(FM1株)、呼吸道合胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ型、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)均具有一定的抗病毒作用，绵马贯众水提取物对上述病毒的EC50分别为110.58、141.72、126.21、152.66、182.55 ng/L;TI分别为34.94，14.21，30.62，25.31，21.17。绵马贯众乙醇提取物对上述病毒的EC50分别为152.08、168.27、132.28、135.26、156.38 ng/L;TI分别为14.24，11.12，16.37，16.01，13.84。绵马贯众水提物高、中剂量组、乙醇提取物高剂量组降低感染FM1株的小鼠肺指数，与病毒对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，0.01)。结论 绵马贯众水、乙醇两种提取物均具有一定的抗病毒作用，可减低病毒引起的肺损伤。

　　【关键词】 贯众分离和提纯; 流感病毒药物作用; 呼吸道合胞病毒药物作用; 腺病毒药物作用; 动物，实验

　　The antiviral research of water and alcohol extracts of Dryopteris Crassirhizoma SUN Kefeng,YU Yan,LI Lijing,et al.The Experimental Center of TCM,the Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM,Shenyang 110032,China

　　【Abstract】 Objective To investigate the antiviral effects of the water and alcohol extracts of Dryopteris Crassirhizoma.Methods (1)The cytopathic method was used to observe the antiviral effects in vitro of the water and alcohol extracts of Dryopteris Crassirhizoma on influenza virus(FM1),respiratory syncyntial virus(Long),para influenza virus(Ⅰ,Ⅲ),adenovirus(AD3);(2)Mice were randomly divided into treated group(25%,12.5%,6.25% extract as high,middle and low dose respectively),normal control group and model group,the in vivo antiviral effects of them were studied in mice infected with influenza virus(FM1) on induced lung index.Results Both the water and alcohol extracts of Dryopteris Crassirhizoma had the antiviral effect on influenza virus(FM1),respiratory syncyntial virus(Long),para influenza virus(Ⅰ,Ⅲ),adenovirus(AD3).EC50 of the water extract was 110.58，141.72，126.21，152.66 and 182.55 ng/L,TI was 34.94，14.21，30.62，25.31 and 21.17.EC50 of the alcohol extract was 152.08，168.27，132.28，135.26 and 156.38 ng/L,TI was 14.24，11.12，16.37，16.01 and 13.84.The water extract 250 mg/L(P<0.01)125 mg/L(P<0.05),the alcohol extract 250 mg/L(P<0.01)Significantly inhibited lung index of mice infected with influenza virus(FM1) increased the injury caused by virus.Conclusions The water and alcohol extracts of Dryopteris Crassirhizoma have the antiviral effect，which can reduce the lung injury caused by virus.

　　【Key words】 Dryopteris Crassirhizoma/separation and purification; Influenza virus/action of drugs; Respiratory syncyntial virus/action of drugs; Adenovirus/action of drugs; Animal,experiment

　　绵马贯众为常用中药，又名东北贯众，其来源为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨Dryopteris crassirhizoma Nakai的干燥根茎及叶柄残基，主产于东北。始载于《神农本草经》，有驱虫、止血、清热解毒的功能，临床上用于风热感冒、虫积腹痛、热毒疮疡、痄腮肿痛、崩漏等。本实验采用离体和在体实验的方法评价绵马贯众两种提取物抗流感病毒(FM1株)、呼吸道合胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ型、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 昆明种小鼠108只，雌雄各半，体质量18～22 g，由吉林大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(吉)20030002。

　　1.2 药品 绵马贯众水、乙醇提取物由辽宁中医药大学提供(每毫升含生药1 g)。阳性对照药利巴韦林注射液(湖北制药有限公司，批号：091022)。

　　1.3 试剂 MTT(3(4，5二甲基噻唑2)2，5二苯基四氮唑溴盐)为Hyclone公司产品，MTT以磷酸盐缓冲液配制成5 g/L溶液，过滤除菌后置4 ℃冰箱保存备用。二甲基亚砜为上海菲达有限公司产品。1%鸡血由来亨公鸡翅下静脉取血，按1∶4加入Alserver液后4 ℃保存,使用时用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液。

　　1.4 细胞 犬肾传代细胞(MadinDarby canine kidney，MDCK)、人宫颈癌传代细胞(Hela)由吉林市防疫站提供。DMEM(Dulbecco′s modified eagle′s mediurn)培养基由美国Gibco公司提供。MDCK细胞生长液中含有10%胎牛血清、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素;MDCK细胞维持液中除含有2%胎牛血清，并加入2 g/mL胰蛋白酶外，其他含量均同细胞生长液。

　　1.5 病毒株 流感病毒(FM1株)、呼吸道合胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ型、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)均购于中国预防科学院病毒学研究所，用于体外抗病毒实验。流感病毒使用前在10日龄鸡胚尿囊腔接种传代3～4次，收集尿囊液，以3 000 r/min离心15 min，取上清液进行血凝实验，将血凝滴度大于1∶320且细菌培养阴性的病毒液分装，置-80 ℃保存备用。FM1株由吉林省疾病预防控制中心提供，用于体内抗病毒实验。

　　1.6 实验仪器 Model680型酶标仪(美国伯乐公司);二级生物安全柜(305040195，France Thermo);CKX41型倒置显微镜(日本奥林巴斯);MCO175型CO2培养箱(日本三洋);AL204型分析天平(MetterThermo Group);LD42A型离心机(上海安亭);Human up 900型超纯水机(韩国Human)。

　　1.7 实验方法

　　1.7.1 药物对MDCK和Hela细胞毒性测定 实验于长春中医药大学中药药理实验室完成。将样品分别配成0.1 g/mL混悬液，0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，分装备用。将96孔板每孔加入2×105个/mL密度的MDCK细胞或Hela细胞0.1 mL，培养至细胞长成单层后，弃去原培养液，换含不同浓度的含药维持液，每孔200 μL。药物的终浓度分别为10、20、40、80、160、320、640、800、1 600 μg/L，置于37 ℃ 5% CO2培养箱培养。每日于倒置显微镜下观察细胞变化，培养72 h后计算细胞存活率，每一药物浓度均重复4孔，同时设正常细胞对照和病毒对照。以Probit回归方法计算药物对MDCK细胞的半数毒性浓度(TC50)。

　　1.7.2 药物对抗病毒作用 先用10TCID50的流感病毒(FM1株)感染MDCK细胞，用呼吸道合胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ型、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)感染Hela细胞，每孔0.1 mL，置于35 ℃ 5% CO2培养箱孵育2 h后，吸去病毒液，加入不同浓度的含药维持液，在35 ℃ 5% CO2培养箱继续培养，每天于倒置显微镜下观察细胞变化;采用致细胞病变法进行试验，待病毒对照孔细胞病变呈+++～++++，且细胞对照正常时，计算细胞存活率，每一药物浓度重复4孔，同时设正常细胞对照和病毒对照，以Probit回归方法计算药物半数有效浓度(EC50)。治疗指数(TI)=药物半数毒性浓度(TC50)/药物半数有效浓度(EC50)[1]。

　　1.7.3 绵马贯众水、乙醇提取物体内抗病毒试验 取昆明种小鼠108只，用抓阄法随机分为9组，正常对照组、阳性对照组(利巴韦林)、病毒对照组及试验药物高、中、低剂量组，每组12只。在乙醚轻度麻醉下，用已滴定的FM1株流感病毒液(以无菌盐水稀释成每0.05 mL含15个LD50)滴鼻感染，每鼠4滴，约0.05 mL。贯众提取物按25%、12.5%、6.25%原液的浓度设高、中、低3个剂量给药，分别为250、125、62.5 mg/kg;阳性对照药利巴韦林剂量为70 mg/kg。以上药物均在病毒攻击后2 h开始灌胃给药，共给药4 d，每日1次。感染后4 d禁食禁水4 h以上，称小鼠体质量，麻醉后处死取出鼠肺，记录病变程度，将肺置于生理盐水的平碟中洗涤2次，用吸水纸吸干表面水分，称出肺湿质量。按以下公式计算肺指数与抑制率：肺指数=小鼠肺湿质量(g)/小鼠体质量(g)×100%;肺指数抑制率=(病毒对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/病毒对照组平均肺指数×100%[2]。

　　1.8 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理，数据以±s表示，计量资料行t检验。

　　2 结果

　　2.1 绵马贯众水、乙醇提取物对MDCK细胞和Hela细胞的半数毒性浓度(TC50)比较 见表1。表1 绵马贯众水、乙醇提取物对MDCK和Hela细胞的半数毒性浓度(TC50)(ng/L)

　　2.2 绵马贯众水、乙醇提取物的抗病毒作用比较 见表2。表2 绵马贯众水、乙醇提取物的抗病毒作用注：EC50：药物半数有效浓度，TI：治疗指数。

　　表2结果表明，绵马贯众水、乙醇提取物对呼吸道合胞病毒(Long)、流感病毒(FM1株)、副流感病毒(Ⅰ型、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)均具有一定的抑制作用。

　　2.3 绵马贯众水、乙醇提取物的体内抗病毒作用 见表3。表3 绵马贯众水、乙醇提取物的体内抗病毒作用(n=12)注：与正常对照组比较，at=7.235，P<0.01;与病毒对照组比较，bt=2.469，P<0.05，ct=5.530，4.162，3.541，P<0.01。

　　表3结果表明，绵马贯众水提物高、中剂量组、乙醇提取物高剂量组对滴鼻感染FM1株的小鼠均有保护作用，可降低流感病毒感染小鼠的肺指数，减轻病区引起的炎症反应，具有一定的抗病毒作用。

　　3 讨论

　　绵马贯众是中药贯众的主流品种，现代研究表明其具有抗肿瘤、抗疟、抗病毒等活性[3]。本课题组利用鸡胚试验进行了抗病毒中药的筛选工作，发现绵马贯众提取物对流感病毒具有显著抑制作用;通过离体试验发现绵马贯众提取物对流感病毒(FM1株)、呼吸道合胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ型、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)均具有一定的抗病毒作用;并通过在体实验，观察到绵马贯众提取物降低感染FM1株流感病毒的昆明种小鼠的肺指数，可减低病毒引起的肺损伤。同时通过实验，观察到绵马贯众水提取物对MDCK细胞、Hela细胞的毒性比乙醇提取物稍大;但是从离体、在体实验结果看到，绵马贯众水提取物的抗病毒活性略好于乙醇提取物，对于水提取物和乙醇提取物抗病毒的活性性成分需要进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1] 柳晓琳，何雅慧，金艳书，等.苦碟子抗呼吸道病毒的实验研究[J].中国现代中药，2006，8(1):1113.

　　[2] 吴萍，郭建生，王小娟.荆杏止咳颗粒抗病毒作用的实验研究[J].中国中医药科技，2005，12(1):3233.

　　[3] 蒋亚生，杨宁.贯众的药理研究进展[J].药学实践杂志，2000，18(1):1718.