水通道蛋白4mRNA在大鼠蛛网膜下腔出血后脑水肿中的表达及尼莫地平对其表达的影响

　　【摘要】 目的：研究大鼠蛛网膜下腔出血后脑组织AQP4mRNA的表达及脑含水量的变化以及应用尼莫地平对AQP4mRNA表达的影响。方法：健康成年大鼠60只，随机分为对照组、假手术组、SAH组、尼莫地平组，建立蛛网膜下腔出血模型，分别在6h、1d、3d、5d、7d个时间点断头取脑，测定脑含水量，并用RT-PCR法检测AQP4mRNA表达。结果：SAH组脑含水量及脑组织内AQP4在6h后即增加，随时相递增，3d达到高峰，较假手术组及尼莫地平组明显增高(P<0.05)。结论：大鼠蛛网膜下腔出血后脑水肿的程度与AQP4的表达成正比，这表明AQP4在蛛网膜下腔出血性脑水肿的病理生理中起着非常重要的作用。尼莫地平可以下调AQP4mRNA的表达，从而减轻脑水肿的程度。

　　【关键词】 蛛网膜下腔出血;尼莫地平;水通道蛋白4;脑水肿

　　Aquaporin-4 expression in rat brain edema after subarachnoid hemorrhage and effect of Nimodipine on aquaporin-4 expression

　　LIAN Xiaoyu,ZHANG Xiufeng,XUAN Zhaobo，GU Zhi[CD*2〗cheng

　　(Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

　　Abstract：Objective：To study the AQP4 expression，brain water content and effect of Nimodipine on the expression.Methods：Sixty normal Wistar rats were divided randomly into four groups: control group, sham operation group, subarachnoid hemorrhage group and Nimodipine group.The changes of the brain water content and AQP4 expression were determined by RT-PCR after subarachnoid hemorrhage at 6h，1d，3d，5d and 7d.Results：The brain water content and AQP4 expression of the subarachnoid hemorrhage group increased at 6h, the two rising with time increasing,and reached peak at 3d,obviously higher compared with the sham operation group and Nimodipine group(P<0.05).Conclusion：The expression of AQP4 is positively related to brain edema degree after subarachnoid hemorrhage, suggesting that AQP4 may play an important role in the pathophysiology of brain edema after subarachnoid hemorrhage. Nimodipine can downregulate the expression of AQP4 and the degree of brain edema.

　　Key words:brain edema; AQP4; Nimodipine; subarachnoid hemorrhage

　　脑水肿是脑出血性疾病的重要并发症之一，可以加重患者病情，导致患者死亡，一直是神经病学研究的热点。其发生发展机制复杂尚不十分明确，临床只有对症处理，缺少有效的治疗方法。有高度选择水通透性的水通道蛋白4，广泛分布与神经系统。笔者通过建立大鼠蛛网膜下腔出血模型，用干湿重法测量脑的含水量，RT-PCR检测AQP4的表达，同时给予尼莫地平干预，观察脑水肿和AQP4的关系以及尼莫地平的干预作用，探讨脑水肿发生的机制，为临床治疗脑水肿新药的开发提供一些思路和理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　健康成年Wistar大鼠60只，雌雄不限，体重250～300g,随即分为4组：对照组5只、假手术组5只、SAH组和尼莫地平组分别按6h、1d、3d、5d、7d5个时间点分为5个亚组，每个亚组各5只。

　　1.2 动物模型制备

　　1.2.1 大鼠SAH模型的制备

　　参照注血法[1],以100g/L水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠并固定，在枕外隆突下方约0.5cm处的枕大池将自体血注入0.3mL,注射速度为0.lmL/min。1d后二次手术，步骤同上，枕大池注血0.2mL。术毕仰卧位，头低30°30min。

　　1.2.2 假手术组模型制备

　　手术过程同SAH组，枕大池注入生理盐水0.3mL,1d后再次注入0.2mL生理盐水。

　　1.2.3 尼莫地平组模型制备

　　枕大池注血2次手术后立即腹腔注射尼莫地平(0.5mg/kg),以后每24小时注射一次。

　　1.3 检测指标

　　1.3.1 脑水含量测定(干湿法测定)

　　去除用于检测AOP4mRNA的部分脑组织，剩余称湿重，然后置于100℃的烤箱中烘烤24h以上至恒重后称重，根据下列公式计算脑组织含水量百分比;脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

　　1.3.2 脑组织AQP4mRNA的RT-PCR测定

　　分别取各组实验动物缺血脑组织后外部分进行RT-PCR分析。采用RNAisoReagent(TaKaRa公司)说明书介绍的方法提取组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量，分装后，-80℃保存备用;利用RT-PCR两步法试剂盒(TaKaRa公司)说明将mRNA逆转录成cDNA，然后再将cDNA进行PCR扩增，取PCR扩增产物进行电泳，电泳结果用凝胶图像分析系统进行电泳条带光密度分析，计算AQP4产物与β-actin产物的光密度积分的比值,作为AQP4mRNA表达的指标。

　　1.4 实验数据与统计学处理

　　分别记录各组大鼠脑组织含水量及AQP4mRNA表达。计量数据以均数加减标准差(x±s)表示，采用SPSS.13.0软件包处理,组间两两比较采用单因素方差分析q检验，P<0.05为差别有显著性意义。

　　2 结果

　　2.1 脑含水量测定

　　见表1。SAH后6h脑组织含水量即增加，随时相递增，3d达高峰。SAH后6h、1d、3d、5d、7d组与对照组比较，差别有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 脑含水量与AQP4mRNA表达的相关性

　　由表1可以看出，脑含水量与对应组AQP4表达的变化规律一致，相关分析得(r=0.768,P<0.01)，表明二者具有正相关性。

　　2.3 脑组织AQP4表达

　　见表1、2，结果显示SAH各时间组较假手术组表达升高，有显著性差异(P<0.05)。尼莫地平组各时间点AQP4表达较SAH各时间点均下降，有显著性差异(P<0.05)。表1 SAH对大鼠脑含水量和AQP4mRNA的影响(略)注：*与对照组和假手术组比较，有显著性差异(P<0.05)。# 与对照组和假手术组比较，有显著性差异(P<0.05)。表2 脑组织AQP4mRNA的比较(略)注：△与▲比较，有显著性差异(P<0.05)。

　　3 结论

　　蛛网膜下腔出血是由于多种原因使血液进入颅内或椎管内的蛛网膜下腔所引起的综合征。蛛网膜下腔出血后引起脑血管痉挛和颅内压增高导致脑组织缺血缺氧，从而脑细胞能量代谢障碍，引发脑水肿。脑水肿是不同的因素，如化学的、物理的、生物性的，影响脑组织，引起脑组织内水分异常增多的一种病理状态，使脑的体积增大，质量也增大。脑水肿属于继发性病理过程，在神经外科方面，如颅脑损伤、颅内占位病变、炎症、脑血管病、寄生虫病及先天性疾病等，经常继发脑水肿。继发脑水肿，往往关系到颅内疾病的过程和预后，具有重要的意义。在神经外科领域，如果能更好的认识脑水肿的发生机理，使脑水肿得到预防和治疗，则能使颅内疾病的治疗取得更好的结果。有报道[2]，脑组织含水量增加的多少，反映脑水肿的程度。

　　本实验将自体血注入大鼠枕大池制作蛛网膜下腔出血，诱发脑水肿，这与临床蛛网膜下腔出血后脑水肿形成的病理生理过程类似。从脑组织含水量的变化可以看出，蛛网膜下腔出血后脑组织含水量6h后即增高，并随时相增高，3d达高峰。SAH后各时间点明显高与对照组与假手术组，有显著性差异(P<0.05)。

　　水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是上世纪90年代初发现的具有高度选择性水通透内在膜蛋白家族，参与调节水的跨膜运输和水的平衡.目前在动物体内发现13种水通道蛋白(AQP0～AQP12)[3]，其中水通道蛋白-4(AQP4)在大脑中分布最广，主要表达于星形胶质细胞和室管膜细胞内，是胶质细胞与脑脊液以及血管间的水调节和转运的重要结构基础。AQP4参与许多病理生理过程，与脑组织的水盐代谢和渗透压的调节有着密切联系，在脑水肿的病理生理机制中发挥重要作用。Taniguchi等[4]在脑梗死后脑水肿的研究中发现，梗死区周围AQP4表达上调，3d后达高峰，可持续7d以上，该变化与磁共振成像(MRI)显示的脑水肿形成和消散结果一致提示AQP4与缺血性脑水肿形成密切相关。Vajda[5]等用肌营养不良小鼠进行水中毒实验，发现肌营养不良小鼠的脑水肿形成延缓，推测是由小鼠缺乏肌营养不良蛋白(dustrophin)，使得AQP4不能正确极化定位与星形胶质细胞，导致该通道进入细胞的水分减少，从而延缓脑水肿的发生。组织中可见AQP4的表达上调。缺乏AQP4的星形细胞对水的通透能力下降达7倍[6]。Verkman[7]等研究发现，敲除AQP4基因可以使急性水中毒或缺血性中风引起鼠脑肿胀明显减轻。Menley[8]等用AQP-4基因敲除小鼠进行急性水中毒实验，发现AQP-4-/-小鼠脑含水量减轻，神经功能缺损程度也减轻，而且成活率高于AQP-4+/+小鼠。国内对于脑卒中后脑水肿与AQP4表达的研究发现[8～10]，AQP4蛋白的表达和脑水含量呈正相关，AQP4表达上调是形成细胞内水肿的关键因素，在脑缺血/再灌注损伤中，AQP4水平的迅速下降可能是机体对脑损伤作出的一种保护性反应。本实验结果，SAH后6h后脑组织AQP4mRNA即增加，并随时相递增，3d达高峰。SAH组AQPmRNA表达均高于对照组与假手术组，有显著性差异(P<0.05)。从脑水含量与AQP4mRNA表达的相关分析可以看出，二者变化规律一致，具有正性相关。提示AQP4mRNA的表达与脑水肿的程度呈正比关系。尼莫地平是二氢吡啶类(DHPs)钙离子拮抗剂,可以透过血脑屏障，与脑组织的亲和力强。其阻滞Ca2+的跨膜细胞内流，并抑制细胞内Ca2+的释放，使细胞内的Ca2+浓度保持在一定的水平。本实验中，尼莫地平组的AQP4mRNA表达均比SAH组低，说明尼莫同可以下调水肿组织的AQP4mRNA表达，从而减轻脑水肿，起到保护脑细胞的作用。目前AQP4的结构功能及病理变化的研究，仅处于起步阶段，随着AQP4的深入研究，将促进人类对脑水肿等疾病的发生、发展及治疗有进一步的认识，亦为治疗脑水肿新药的开发提供一些思路和理论依据。是否可通过水通道蛋白抑制因子抑制表达过多的水通道蛋白或通过控制水通道蛋白的调节机制来平衡液体的渗出与吸收，从而达到减轻或预防脑水肿的发生，尚待深入研究。

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