青霉素钠中致使鲎试验阳性的非内毒素物质的鉴别

　　【摘要】 通过对数批青霉素钠作细菌内毒素分析，实验结果证明某些青霉素钠中含的致使鲎试验阳性的物质不是内毒素。本文主要介绍对存在青霉素钠中致使鲎试验阳性的非内毒素物质的鉴别。

　　【关键词】 青霉素钠; 细菌内毒素; 鲎试验非内毒素反应物(TAL-RM)

　　Differentiation of non-endotoxin in penicillin sodium

　　causing positive TAL test results

　　Chen Yu1, Wei Qun1, Feng Ju-jin1, Liang Dan1, Guo Gui-fang2 and Cao Yan-ling2

　　(1 Zhanjiang A&C Biological Ltd., Zhanjiang 524022;

　　2 General Pharmaceutical Factory of Harbin Pharmaceutical Group, Harbin 150086)

　　ABSTRACT Bacterial endotoxin test for several batches of penicillin sodium products showed that some materials leading to positive TAL reaction were non-endotoxins. This paper mainly introduced how to differentiate non-endotoxin TAL-reactive materials existing in penicillin sodium, which caused the positive TAL test results.

　　KEY WORDS Penicillin sodium; Bacterial endotoxin; TAL-reactive materials (TAL-RM)

　　青霉素钠是中国药典收载用细菌内毒素检查法[1](BET)检查的品种。在对青霉素钠产品做BET检查时发现，有几批产品使用不同批号的鲎试剂或不同厂家的鲎试剂检查有不同的结果。为此我们对数批青霉素钠样品作了如下的实验分析。

　　1 材料

　　1.1 样品(S)

　　青霉素钠，内毒素限值(L)0.01EU/100U，含量96%，1670U/mg。样品编号1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#和8#。

　　1.2 细菌内毒素国家标准品(RSE)

　　批号981，9000EU/支，中国生物制品检定所。

　　1.3 鲎试剂(TAL)

　　(1)批号0508150和0509060，λ 0.125EU/ml，规格为0.1ml/支; 批号060217SB(除G因子TAL)， λ0.25EU/ml，规格为0.5ml/支，均为湛江安度斯生物有限公司(以下简称为A公司)产品。

　　(2)批号H450L，λ 0.125EU/ml，规格为5.2ml/瓶，CHARLES RIVER Endosafe公司(以下简称为B公司)产品。

　　(3)批号0511020，λ 0.125EU/ml，规格为0.1ml/支，为另一TAL厂家(以下简称为C公司)产品。

　　1.4 抗增液(KS)

　　批号0307250，规格为0.6ml/支，A公司产品。

　　1.5 (1-3)β-D葡聚糖标准品(β-Glucan)

　　批号L84562，规格为1mg/ml，B公司产品。

　　2 方法与结果

　　以下所有实验均按中国药典2005版细菌内毒素检查法要求操作。所用5批TAL灵敏度复核的结果均符合BET法要求。2.1 实验一

　　青霉素钠样品对不同厂家TAL的反应比较。

　　样品检测浓度为1.2mg/ml。检查结果见表1(PPC为标准内毒素)。

　　表1结果显示，青霉素钠样品确实存在着对不同TAL反应差异的现象。特别是2#样品，不同批号以及不同厂家的TAL反应有不同的结果，这类样品中所含的能使鲎试验阳性的物质是内毒素还是鲎试剂非内毒素反应物(TAL-RM)?我们对此进行了一系列的分析鉴别试验。

　　2.2 实验二

　　对实验一检查结果呈阳性的样品(2#和3#)用KS(G因子旁路抑制剂)复溶TAL再检查，进行β-葡聚糖类物质鉴别。

　　样品编号2#和3#的检测浓度为1.25mg/ml。用BET水稀释β-D葡聚糖标准品至0.1mg/ml。

　　制备0.25EU/ml的标准内毒素溶液(E0.25)，检查结果见表2。

　　表2结果显示，用BET水复溶的TAL对β-葡聚糖反应阳性;用KS复溶的TAL对β-葡聚糖不反应，也不影响对内毒素(E0.25)的反应。2#样品对用BET水或KS复溶的TAL全部反应呈阳性，表明2#样品所含的鲎试验反应物不是β-葡聚糖，可能是内毒素或是其它的TAL-RM。3#样品对用BET水复溶的TAL个别厂产品有反应，对用KS复溶的TAL不反应(阴性)，表明3#样品所含的鲎试验反应物是β-葡聚糖。

　　2.3 实验三

　　表3为样品与除G因子TAL的反应实验结果，样品编号2#和3#的检测浓度为3.12和1.56mg/ml。

　　表3结果显示，除G因子TAL只对内毒素反应，不与2#、3#及β-葡聚糖反应，提示2#、3#样品所含的鲎试验反应物不是内毒素。

　　2.4 实验四

　　样品对TAL的反应性与时间的关系见表4。样品编号2#; 检测浓度为1.56mg/ml; TAL批号0508150。

　　实验方法

　　(1)把样品制备成1.56mg/ml溶液，室温(20℃)放置0.5h或5h，然后进行BET。

　　(2)把样品制备成含2λ(0.25EU/ml)标准内毒素的1.56mg/ml浓度溶液(PPC)，室温(20℃)放置0.5及5h，然后进行BET。

　　(3)制备0.25EU/ml的标准内毒素溶液(E0.25)，室温(20℃)放置0.5h及5h，然后进行BET。表4结果显示，2#样品溶液的鲎试验反应能力会随放置时间衰减，反应结果由阳性变为阴性;而标准内毒素(PPC及E0.25)没有这种现象。此实验结果进一步验证了2#样品所含的鲎试验反应物不是内毒素。

　　3 讨论

　　已知普通的鲎试剂有两条凝集反应途径：

　　途径一：内毒素-→C因子-→B因子-→凝固酶-→凝胶

　　途径二：TAL-RM-→G因子-→凝固酶-→凝胶

　　研究已证实(1-3)和(1-4)β-D葡聚糖是TAL-RM，当然还有其它的TAL-RM。使用安度斯公司的抗增液(KS)复溶TAL，能使TAL具有抗(1-3)β-D-葡聚糖干扰的能力，极显著地提高TAL对内毒素反应的特异性。研究表明[2]大多数的BET假阳性是由这种TAL-RM引起的。但KS对其它的TAL-RM无效。因此，只有无G因子TAL或除G因子TAL才是真正意义上的BET特异性鲎试剂。

　　另一方面需要指出的是，鲎试剂的差异是一个客观事实。鲎试剂是一种生物试剂，姑且不论鲎试剂的制备技术及制备工艺差异能导致鲎试剂产品的性能或质量差异，仅是鲎试剂原料的差异目前人们就难以消除。鲎试剂的原料都是来自十几只甚至几十只鲎的阿米巴细胞混合液，每只鲎的体质差异就有可能导致最终鲎试剂产品的差异。我们认为，应尽快对鲎试剂质量标准、鲎试验结果的假阳性辨别等方面作相应的修订。

　　【参考文献】

　　[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)[S]. 北京：化学工业出版社，2005，附录XI E，85.

　　[2] 钟劲松，冯聚锦. 葡萄糖氯化钠注射液细菌内毒素检查假阳性原因的探讨[J]. 中国药学杂志，2002，37(6)：449～451.