枸杞多糖对大鼠坐骨神经离断后神经生长因子表达的影响

　　【摘要】 目的 研究枸杞多糖对大鼠坐骨神经离断后神经生长因子(NGF)表达的影响。方法 雌性SD大鼠72只，随机分成空白对照组、模型组与枸杞多糖(LBP)组，每组24只，后两组切除右侧坐骨神经2cm，LBP组腹腔注射枸杞多糖10mg/(kg·d)，模型组给予相同剂量生理盐水，分别于给药后第7、14、21和28d取坐骨神经离断的近端神经及相连背根神经节和相对应的脊髓(每组6只)，应用免疫组织化学方法分析神经生长因子表达的变化。利用Image-pro plus 6.0图像分析系统进行半定量分析。结果 模型组和LBP组的坐骨神经及相连背根神经节和相应的脊髓NGF免疫组化平均光密度高于空白对照组，LBP组坐骨神经、脊神经节及脊髓中的NGF免疫组化平均光密度在术后第7、14、21、28d均低于模型组组(P<0.05)。 结论 枸杞多糖可抑制大鼠坐骨神经离断后近端及相应的节段神经节和脊髓组织中的神经生长因子量的表达。

　　【关键词】 枸杞多糖;坐骨神经离断;神经生长因子

　　Effect of Lycium Barbarum Polysaccharides on Expression of nerve growth factor after sciatic nerve mutilation in rats

　　FAN Hong-wei， et al.(Ningxia Medical University,Yinchuan 750001,China)

　　[Abstract] Objective To investigate the effect of Lycium barbarum polysaccharides(LBP) on expression of nerve growth factor (NGF) after sciatic nerve mutilation in rats. Methods 72 female SD rats were randomly divided into three groups: Control group, Model group and Lycium Barbarum Polysaccharides(LBP) group, Model group and LBP group were wipe off 2cm right sciatic nerve,LBP group were intraperitoneal injected LBP 10mg/(kg·d),Model group were given physiological saline,Control group were treated without any treatment.Six rats were choosed randomly and the near-heart never of sciatic nerve and conjoint dorsal root ganglia and spinal cord were obtained on the7th,14th,21st and 28th day;Immunohistochemistry and Image-pro plus 6.0 were used to evaluate the expression of NGF.Results The expression of NGF positive area and Average optical density in Control group are obviously lower than the other group. The NGF Average optical density in sciatic nerve,dorsal root ganglia and spinal Cord in LBP group are obviously lower than that in Model group on the 7th，14th，21st，28th day(P<0.05).Conclusion LBP can inhibition the expression of NGF the related nerve ganglion and spinal cord after sciatic nerve divided in rats. expression of NGF owned in sciatic nerve and its related nerve ganglion and spinal cord after sciatic nerve dividing in rats.

　　[Key words] Lycium barbarum polysaccharids ;Sciatic nerve mutilation; Nerve growth factor

　　周围神经损伤 (peripheral nerve injury，PNI)后局部发生免疫应答，免疫应答强度与损伤程度相关，当神经损伤重，免疫反应答增强，神经再生差，神经损伤后的免疫应答对神经再生有一定抑制作用。枸杞多糖(Lyceum Barbarum Polysaccharids,LBP)作为一种免疫增强剂，作用于大鼠坐骨神经离断吻合后模型，抑制其神经再生，目前已有报道[1]，但有关分子机制尚未见报道。近年来，人们对神经生长因子(nerve growth factor，NGF)进行了较为深入的研究，发现它对正常神经系统发育、分化及维持神经元特殊功能有重要的作用，在神经系统损伤后有修复与营养作用。本研究通过观察枸杞多糖对坐骨神经离断后损伤断端、相应节段脊神经节及脊髓组织中NGF表达的影响，探讨LBP对神经离断后抑制再生的分子机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验分组:健康雌性SD大鼠72只[宁夏医科大学动物实验中心提供，合格证号SCXK(宁)2005-0001]，体重200-220 g,随机分成3组： 空白对照组，模型组与LBP组，每组24只,其中模型组、LBP组又按坐骨神经离断后不同时间点(7、14、21、28d)分为4个亚组，每个亚组6只。

　　1.2 主要试剂和仪器:LBP由宁夏回族自治区启元药业提供， 批号：GF 030021-1，浓度58.56%;一抗Rabbit Anti-NGFbeta 0.1ml/瓶, 免疫组化即用型 SABC试剂盒,DAB显色剂 ,抗体稀释液,防脱玻片,PBS缓冲液,枸橼酸盐缓冲液;4%多聚甲醛 均购买武汉博士得生物工程有限公司。LKB-V超薄切片机(瑞典);BMJ-ΑⅢ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 动物模型建立:首先3.5%水合氯醛腹腔注射(350mg/kg)麻醉,术区脱毛，将大鼠俯卧位、四肢伸展固定于手术台上，常规消毒后取右后正中切口，显露坐骨神经，距梨状肌下缘0.5cm处切断坐骨神经，向远端游离去除2cm，关闭切口，术后LBP组腹腔注射枸杞多糖(LBP)10mg/(kg·d)，模型组术后腹腔注射等量生理盐水，1天1次，空白对照组不做任何处理。

　　1.3.2 取材时间及标本制备:分别于手术后第7、14、21、28d，用3.5%水合氯醛麻醉，开胸，暴露心脏。经左心室插管至升主动脉，灌注 0.9%氯化钠溶液150-200ml，然后再灌注预冷的4%多聚甲醛固定液300 ml，30 min内灌注完。灌毕立即取坐骨神经离断近端、相应节段的神经节及脊髓，置入10%中性甲醛液固定24h，流水冲洗30 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡切片。

　　1.3.3 免疫组化法检测:采用 SABC三步法。切片常规脱蜡至水，3%H2O2以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水洗3次。再将切片侵入0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH 6.0)微波炉加热3min，冷却后PBS洗涤2次，5%BSA室温下封闭20min，滴加适当(50μl)稀释一抗(兔抗鼠多克隆抗体)4℃过夜。PBS冲洗，滴加生物素化山羊抗兔 lgG，37℃20 min ，冲洗后滴加试剂SABC，37℃20 min，再次冲洗后.DAB室温显色，镜下控制反应时间，即时终止。苏木素复染、脱水、透明、封片。对照组设计：以PBS代替一抗为阴性对照。阳性为棕黄色，阴性不显色。

　　1.3.4 图像分析及统计学处理:每只大鼠随机取6张相同序数的坐骨神经、脊神经节与脊髓免疫组化染色切片，显微镜下观察并拍照。Image-pro plus 6.0图像分析系统，每张切片随机选取3个高倍视野测定免疫组化图像中平均光密度。

　　1.4 统计学方法：实验数据用SPSS 11.5统计软件进行分析，组间比较用t检验。

　　2 结果

　　正常坐骨神经组织中NGF表达较低，平均光密度(0.214±0.076) 、脊神经节NGF平均光密度(0.321±0.088)和脊髓中NGF平均光密度(0.310 ±0.083)。神经离断后，LBP组和Model组神经离断近端及与坐骨神经相连脊神经节和与其相连脊髓节段组织中NGF表达出现不同程度的增加，但LBP组在术后7、14、21、28d NGF平均光光密度小于Model组，差异有统计学意义( P<0. 05)。见表1-3、图1-6(封二)。表1 坐骨神经中NGF的表达

　　3 讨论

　　以往的研究一直认为周围神经组织是免疫的赦免区，而近年来的研究则发现周围神经损伤及发生病变时，免疫系统也发生一系列的变化，表现为神经末端发生瓦勒氏变性，髓鞘溃变，神经组织有巨噬细胞聚集、T细胞浸润和主要组织相容性复合体(major histocompati-bility complex，MHC)Ⅱ类分子表达增强及IgG在神经束膜和内膜上沉积等一系列免疫应答，从而影响神经的修复和再生。大鼠坐骨神经断伤后，其血-神经屏障被破坏，即神经免疫豁免区被突破，这样就使神经损伤局部的免疫应答增强。而神经损伤后免疫应答增强对神经再生起着抑制作用[1]，但具体的分子机制还不十分清楚。

　　NGF是神经系统最主要的生物活性分子之一，也是最早发现和最典型的神经营养因子，对神经元的发育、分化、维持正常功能及防止神经元胞体在神经损伤后发生退变死亡具有极其重要的作用[3]。广泛的研究证明NGF能保护神经元活性，促进轴突的出芽生长;刺激雪旺细胞表达神经细胞黏附分子，有助于雪旺细胞的迁移[4]，并介导轴突的延伸，因此NGF促进轴突再生的作用有一部分是通过刺激雪旺细胞产生黏附分子来实现的。正常坐骨神经组织中存在低水平的NGF mRNA，当坐骨神经损伤后NGF表达增高。大量的实验研究表明，当神经细胞损伤后，NGF不仅可以保护其效应神经元，减少其变性死亡，还可以促进再生神经纤维的生长，有利于神经功能的恢复[5]。神经组织中NGF蛋白增高不但可以引导神经的再生，而且随着轴突的生长，生长锥的不断前移，其表面受体与NGF相结合，通过胞饮作用摄入，经逆行轴浆转运输送到神经元的胞体，支持神经元的生长，促进神经的再生[6]。本实验结果表明LBP组的大鼠的坐骨神经离断近端、及相应脊神经节及脊髓组织中的NGF表达在术后7、14、21、28d均低于模型组。LBP是从枸杞子中提取的一种生物活性物质，药理作用甚广，能够抗衰老、抗肿瘤、增强免疫作用，尤其对免疫功能有重要的调节作用，它是一种全身性的免疫增强剂，此外，LBP还具有抑制肿瘤生长的作用。LBP对周围神经损伤早期的修复起到抑制作用已有实验证实[1]，本实验结果表明LBP可通过降低损伤神经组织中NGF水平，从而增加细胞凋亡，抑制神经再生。外周神经损伤时，局部增殖的雪旺细胞则成为NGF合成和分泌的主要来源。有学者证实LBP还可诱导IL-6、TNF、IFN-γ的产生，发挥肿瘤免疫的作用[7]。而γ-干扰素和胶质细胞成熟因子β对雪旺细胞增殖也有抑制作用[8]，LBP可能通过抑制雪旺细胞的增殖进而减少NGF的表达。本实验证明免疫增强剂LBP对神经损伤的修复起到抑制作用的结果，与陈国奋[9]等研究发现FK506免疫抑制剂加速周围神经损伤修复的结果相互支持。此外周围神经断裂后大多数都会形成创伤性神经瘤,有文献报道抑制NGF能够阻止创伤性神经瘤的形成[10]。本实验结果表明LBP能够抑制大鼠坐骨神经离断后神经生长因子的表达，能否早期对神经离断而无法连接的患者使用LBP进而抑制创伤性神经瘤的形成有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] 王琳，马玉林.枸杞多糖对大鼠坐骨神经损伤修复后影响的实验研究[J].宁夏医学杂志，2004，26(5)264-265.

　　[2] 裴福兴，杨志明，黄富国，等.周围神经损伤后的免疫学反应与神经再生[J].中华显微外科杂志，1995，18:146-148.

　　[3] Aloe L,Rita Levr.Montalcini: the discovery of nerve growth factor and modern neurobiology[J]. Trends cell Biol， 2004，14(7):395.

　　[4] Mirnics ZK,Yan CHH,Portugal C,et a1.P75 neurotrophin receptor regulates expression of neural cell adhesion molecule [J]. Neurobiol Dis， 2005，20(3)：969-985.

　　[5] Micera A，Puxeddu I，Aloc L，et al.New insights on the in-volvement of nerve growth factor in allergic inflammation andfibrosis[J].Cytkinc Growth Factor Rev，2003，14(5):369.

　　[6] Bennett MR， Gibson WG， Lemon G. Neuronal cell death，nerve growth factor and neurot rophic models :50years on[J].Auton Neurosci，2002，95(1):1.

　　[7] 张罗修.免疫药物研究与临床应用 [M].上海:上海医科大学出版社，1998:101.

　　[8] Eccleston PA， et al. Sponta-neous immortalisation of Schwann cells in cul- ture:short-term cultured Schwann cells secrete growth inhibitory activity[J].Development，1991，112:33

　　[9] 陈国奋，顾立强. FK506加速周围神经损伤修复后的功能恢复[J].中华手外科杂志，2002，18(2):113-115.

　　[10] Kryger GS，Kryger Z， Zhang F， et al.Nerve growth factor inhibition prevents traumatic neuroma formation in the rat[J]. J Hand Surg,2001, 26A:635-644.