红花注射液对佐剂性关节炎大鼠的免疫调节作用

　　【摘要】 目的：本课题主要研究红花注射液对佐剂性关节炎大鼠(AA)的免疫调节作用。方法：模型制作第15天，给予动物相应药物治疗。治疗20d后，大鼠心脏采血。取全血做TC亚群计数，留取血清用ELISA法测血清IL-1含量;取大鼠腹腔液涂片，做巨噬细胞吞噬功能测定。结果：在红花注射液的作用下，佐剂性关节炎大鼠的巨噬细胞吞噬指数和吞噬百分率、CD+4T细胞与CD+8T细胞比值及血清IL-1含量均显著降低。结论：红花注射液可以调节佐剂性关节炎大鼠过于亢进的免疫自稳功能，其治疗效果与雷公藤甲素相仿。

　　【关键词】 红花注射液;类风湿关节炎;免疫调节

　　Immunoregulatory effect of Safflower Injection on adjuvant arthritis rats

　　SHANG Yu,WANG Jianjie,MA Shuxia,YANG Yu,WANG Xiaoling

　　(Department of Immunology, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

　　Abstract: Objective： To study the immunoregulatory effect of Safflower Injection on adjuvant arthritis(AA)in the rats. Methods： we began to give the corresponding medicine to rats on Day days after model building. We took blood from the rat heart after 20-day treatment. Whole blood was used to assay the T cell subgroup. Blood serum was used for the IL-1 level by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Rat peritoneal fluid was used for smear and then for the determination of macrophage phagocytosis.Results:The effect of safflower injection,rats with adjuvant arthritis phagocytic index and phagocytic percentage,CD+4 T cells and Cd+8 T cell ratio and serum IL-1 levels were significantly lower. Conclusion： Safflower Injection can regulate the hyperfunction of the immune homeostasis of AA rats, and its treatment effect is similar to that of Triptolide.

　　Key words: Safflower Injection; rheumatoid arthritis; immune regulation

　　类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的自身免疫性疾病，以滑膜组织炎性增生，关节破坏为基本特点[1]。红花具有活血、散瘀、降压等功效，主要用于治疗跌打损伤，对冠心病、血管栓塞性疾病等亦有一定的疗效。红花注射液(safflower injection, SI)是红花的成分提取物。本实验采用佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠作为动物模型，研究红花注射液对佐剂性关节炎大鼠的免疫调节作用。

　　1 实验材料与动物

　　1.1 实验材料

　　红花注射液，山西亚宝药业集团产品，含生药0.1g/mL，4℃冰箱保存备用。

　　1.2 实验动物

　　雌性Wistar大鼠60只，体重(180±15)g，购于佳木斯大学动物实验中心。

　　2 实验方法

　　2.1 动物分组

　　大鼠随机分为4组，每组15只。依次为：正常对照组(N)，模型对照组(M)，雷公藤甲素治疗组(TP)，红花注射液治疗组(SI)。

　　2.2 制备大鼠佐剂性关节炎模型

　　取液体石蜡、无水羊毛脂与卡介苗冻干粉，制备弗氏完全佐剂(FCA)(卡介苗终浓度1mg/mL)。除正常对照组外，各组大鼠于右后足跖皮内注射FCA 0.1mL，每天1次，免疫25d。

　　2.3 给予药物治疗[2，3]

　　TP组和SI组于造模第15天开始给予动物药物治疗。方式：尾静脉注射，每日1次，连续给药20d。剂量：雷公藤甲素0.04mg/千克·只，红花注射液150mg/千克·只。N组与M组给予生理盐水(0.6mL/天·只)替代。

　　2.4 标本采集及指标检测

　　2.4.1 标本采集

　　治疗20d后，处死大鼠。取大鼠心脏血，用于TC亚群计数及ELISA法测定IL-1。

　　2.4.2 T细胞(TC)亚群测定

　　取大鼠肝素抗凝血2mL，分离有核细胞，制备细胞悬液，推片，固定，染色，在高倍镜下观察200个淋巴细胞，计数CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞及计算CD4+T/CD8+T的值。

　　2.4.3 血清IL-1测定

　　用ELISA法测定血清IL-1，按试剂盒说明书操作。

　　2.4.4 巨噬细胞吞噬功能测定

　　大鼠腹腔注射5%鸡红细胞(CRBC)1mL。40min后，处死大鼠，吸取腹腔液，制涂片，瑞氏染液染色，镜检，寻找巨噬细胞，计算巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数。

　　吞噬百分率=吞噬有CRBC的细胞数/100个巨噬细胞×100%

　　吞噬指数=100个巨噬细胞中吞噬的CRBC /100

　　2.5 统计学处理

　　数据以均数±标准差(x±s)表示表示，经正态性检验和方差齐性检验。若服从正态性和方差齐性，用单因素方差分析，两两比较用q检验;若不服从正态性和方差齐则采用秩和检验。数据的分析采用用SPSS13.0统计软件进行处理。

　　3 实验结果

　　3.1 模型观察

　　FCA注射后的第3天，大鼠出现全身反应和明显的局部急性炎症反应，表现为毛色暗黄无光、倦怠，注射部位红肿、溃烂;第10天大鼠发生全身广泛性炎症，表现为鼠尾、四肢均出现红肿，体重下降。第25天，大鼠后肢出现屈曲位畸形，活动明显受限，同时尾部出现炎性小结，提示佐剂性关节炎模型成立。TP组和SI组连续给药20d后观察，发现大鼠后肢肿胀部位有所消退，提示治疗有效。

　　3.2 巨噬细胞吞噬功能测定

　　见表1。表1 各组大鼠巨噬细胞吞噬功能比较(略)

　　结果表明，红花注射液可以降低大鼠巨噬细胞吞噬指数和吞噬百分率，M组高于N组(P<0.05)，TP组低于M组，有显著性差异(P<0.05);SI组与M组比较有显著性差异(P<0.05)，SI组与TP组比较无显著性差异(P>0.05)。

　　3.3 TC亚群测定

　　见表2。表2 大鼠TLC亚群计数及比值(略)

　　由表可知，M组与N组比较有显著差异(P<0.05)，TP组与M组比较有显著差异(P<0.05)，SI组与M组比较有显著差异(P<0.05)，SI组与TP组比较无显著性差异(P>0.05)。

　　3.4 红花注射液对佐剂性关节炎大鼠外周血IL-1的影响

　　见表3。表3 各组大鼠外周血IL-1的比较(略)

　　结果经分析可知，M组与N组比较有显著差异(P<0.01)，TP组与M组比较有显著差异(P<0.01)，SI组与M组比较有显著差异(P<0.01)，SI组与TP组比较无显著性差异(P>0.05)。

　　4 讨论

　　T细胞介导适应性细胞免疫应答，正常人CD4+T细胞与CD8+T细胞处于平衡状态，而RA患者往往发生偏移。亢进的CD4+T细胞可以通过分泌炎性细胞因子促进RA的发生发展。在本次实验中，模型组大鼠CD4+T细胞/CD8+T细胞的比值明显升高，说明AA大鼠适应性细胞免疫应答出现紊乱。通过治疗，SI组大鼠CD4+T细胞/CD8+T细胞降低，说明红花注射液可以下调AA大鼠过于亢进的CD4+T细胞应答，纠正AA大鼠的细胞免疫紊乱。巨噬细胞是重要的固有免疫应答细胞。RA患者巨噬细胞被过度活化并释放炎症介质，引起局部炎症，尤其是关节滑膜炎。在本次实验中，模型组大鼠巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数明显升高，表明巨噬细胞处于高度活化状态。通过治疗，SI组大鼠巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数降低，说明红花注射液可以抑制AA大鼠巨噬细胞过度活化，纠正AA大鼠的固有免疫紊乱，减少自身免疫应答对机体的损伤。IL-1是十分重要的促炎细胞因子，具有多方面作用，如：[4]IL-1可以刺激成纤维细胞和软骨细胞产生胶原酶和PG，导致骨和软骨破坏。取血清测定IL-1，模型组大鼠IL-1明显高于正常，而TP组及SI组的IL-1相对于模型对照组均有所降低，提示红花注射液具有抑制AA大鼠炎症细胞因子合成分泌的作用，其疗效与雷公藤甲素类似。　　综上所述，红花注射液可以从免疫细胞与免疫分子两个方面纠正AA大鼠所存在的严重免疫紊乱。红花注射液与雷公藤甲素的效果没有明显差别。雷公藤甲素是一种具有很强的免疫抑制作用的中药提取物，对RA有确切的疗效;但副作用大，限制了它的应用。红花注射液的副作用很小，因此可以考虑作为雷公藤甲素的替代药物单独应用或与其他药物配伍，用于纠正RA患者的免疫紊乱，作为一种辅助药物应用于临床。

　　【参考文献】

　　[1]王勇民,明章银,吴基良.红花注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响[J]. 咸宁医学院学报，2000，14(4):248249

　　[2]杨琴，杨桂枝，王蕾.雷公藤多甙对佐剂性关节炎模型大鼠的作用[J]. 四川解剖学杂志，2006，14(1):1112

　　[3]高飞,吴小候,罗春丽.红花注射液对大鼠肾缺血再灌注损伤的疗效及机制研究[J]. 中国中药杂志，2006，31(21):18141816

　　[4]Vuolteenaho K，Moilanen T，Hamalainen M. Regulation of nitric oxide production in osteoarthritic and rheumatoid cartilage,Role of endegonous IL-1 inhibitors[J].Scand J Rheumatol，2003，32(1):1924