成骨细胞/CPC复合材料对兔下颌骨缺损的影响

　　【摘要】 目的：研究成骨细胞体外培养后复合自固化磷酸钙人工骨(calcium phosphate cement,CPC)修复骨缺损的效果。方法：18只家兔自体成骨细胞培养至第3代在双侧下颌骨设直径1cm圆形人工骨缺损,并植入A组成骨细胞复合自固化磷酸钙材料。B组自固化磷酸钙材料分别于4、8、12周处死取材进行X线片、组织学观察。结果：A组骨缺损修复区X线片：骨组织边界逐渐模糊均匀一致，组织学观察：大量骨小梁形成网状和板状排列板层骨形成，实验结果均优于B组。结论：自体成骨细胞复合自固化磷酸钙人工骨修复兔下颌骨缺损具有良好的骨形成作用。

　　【关键词】 成骨细胞;细胞培养;CPC; 骨缺损

　　Influence of osteoblasts/calcium phosphate cement

　　composite material on rabbit mandibular defects

　　DENG Huixin,GUAN Jian,ZHU Liping,WANG Xinyu,ZHANG Guoliang,YIN Hanwen

　　1. The Second Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154002, China;2. Harbin Municipal First Hospital, Harbin 150010, China

　　Abstract: Objective： To investigate the effect of autologous osteoblasts combined with self-solidified calcium phosphate cement (CPC) in bone defect repairing. Methods：The autologous osteoblasts of 18 rabbits were cultured to the third generation and 1cm diameter bilateral mandibular bone defect was made and implanted into autologous osteoblasts combined with self-solidified CPC. Osteoblasts were combined with self-solidified CPC of Group A and self-solidified CPC of Group B, respectively. The rabbits were sacrificed at 4, 8 and 12 weeks for X-ray and histological observation. Results：Radiologically, the bone defect repairing area of Group A showed a blurred and uniform bone tissue boundary and histologically, a large number of bone trabeculae forming mesh-like and plate-like arrangement, causing the formation of lamellar bones compared with Group B. Conclusion：The compound material of autologous osteoblasts combined with self-solidified CPC is good for bone formation in artificial repairing of the rabbit mandibular defect.

　　Key words: osteoblast ;cell culture;calcium phosphate cement ;bone defect

　　颌骨缺损是口腔颌面外科的常见病，它可由多种原因引起，例如外伤、肿瘤、畸形等。因而找到骨缺损修复的材料很重要，已有实验证明骨髓具有成骨作用[1]骨髓基质内包含成纤维细胞、网织细胞、脂肪细胞、成骨细胞、骨内衬上皮细胞等[2～4]，因此本实验采用自体骨髓血培养出骨髓基质细胞并纯化出成骨细胞复合自固化磷酸钙人工骨修复兔下颌骨缺损，为临床提供一条新途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及材料

　　新西兰大白兔18只,体重2.5kg左右。佳木斯大学动物中心提供，自固化磷酸钙人工骨(I)型，上海瑞邦生物材料有限公司提供。

　　1.2 主要实验试剂仪器

　　DMEM培养液(天津市灏洋生物制品科技有限公司)，胎牛血清(Hycolon)，胰蛋白酶(Gibco) ，IX70- S8F2 型倒置相差显微镜(日本Olympus)，二氧化碳培养箱(FormaCo)。

　　1.3 成骨细胞体外培养、纯化

　　18只兔称重后1%戊巴比妥钠(1mL/kg)经兔耳缘静脉注射麻醉。常规剃毛、消毒后，18号穿刺针抽取新西兰大白兔髂骨处骨髓2毫升/只置于含有肝素的抗凝管中用DMEM培养液进行体外培养,2～3d换液一次,12～14d进行传代,细胞改用条件培养液培养[5]，培养出的骨髓基质细胞根据成骨细胞的贴壁速度纯化出成骨细胞[6]。1.4 成骨细胞与材料复合

　　材料A:采用体外培养的兔第3代成骨细胞无菌条件下将细胞收集计数,按5.0×105/mL的细胞量接种于无菌调合板预先置入材料1g调匀。材料B:另设对照组不加细胞，将空白材料置于培养基内调匀。

　　1.5 手术方法及材料植入

　　1%戊巴比妥钠(1mL/kg)经兔耳缘静脉注射麻醉,在兔颏下术区备皮,消毒、严格无菌条件下,沿颏下正中线经皮肤切口暴露双侧下颌体中份, 以牙钻造成直径1. 0cm深0.3cm的人工骨缺损, 保留颊、舌侧骨膜。生理盐水反复冲洗创区。18只兔用自身对照法，实验组:左侧骨缺损植入材料A,对照组:右侧骨缺损植入材料B，庆大霉素再次冲洗创腔, 严密缝合创口。术后3d连续肌注盐酸庆大霉素(每只家兔8万单位) 1次 /日，于术后4、8、12周取材观察实验效果。

　　1.6 观察指标

　　1.6.1 成骨细胞特性鉴定

　　倒置显微镜观察成骨细胞的形态、ALP染色、I型胶原免疫组织化学染色,检测成骨细胞的生物学特性和形态特征。

　　1.6.2 兔下颌骨缺损区的观察

　　① X 线摄片;② 组织学观察。

　　2 结果

　　2.1 成骨细胞鉴定结果

　　通过倒置显微镜、ALP染色、1型胶原免疫组织化学染色,进行观察,证实细胞具有成骨细胞的生物学特性和形态特征,并能在体外形成钙化的骨样组织。

　　2.2 骨缺损区X 线摄片

　　实验组:第4周与骨紧密接触,形成模糊骨痂,密度低于正常骨(图A);第8周骨缺损处完全由高密度影所覆盖,材料面积明显减少;第12周可见材料与正常颌骨间达骨性连接(图B)。对照组:第4周缺损区与骨之间填充物边缘清晰，少量骨痂形成(图C) ;第8周充填物边缘与颌骨间见带状低密度影材料面积略有较少;第12周边界线模糊可见,表面不光滑充填材料仍可见(图D)。

　　2.3 组织学观察

　　实验组:术后4周,骨缺损由纤维骨痂充填, 岛状纤维组织开始长入;术后8周，缺损区新生骨,骨小梁明显增多;术后12周骨小梁排列整齐新生骨面积扩大出现均匀皮质骨结构和排列均匀的骨小梁。对照组: 术后4周时无明显变化少量软骨细胞聚集;术后8周时少量骨痂形成出现骨小梁;术后12周时骨性骨痂增多，较多新生骨充填缺损区, 皮质厚薄不均, 形态不规则。

　　3 讨论

　　骨缺损修复最常用的方法是自体骨或异体骨移植，但自体骨移植的不足是取骨数量受限、影响供骨区生物力学强度和功能、增加患者创伤和痛苦等[7];自固化磷酸钙人工骨为非陶瓷型羟基磷灰石类人工骨，具有良好的生物兼容性、骨传导性和可降解性[8]。骨髓基质细胞能在适当的条件下可以分化为成骨细胞复合材料后具有成骨性。本实验考虑到异体成骨细胞的提取容易导致排斥与感染等不良反应且能够让机体的损伤小和供体者能够减少痛苦等因素，因而采用提取自体骨髓血的方法来体外培养成骨细胞与材料结合。实验制备的复合物具有良好的可塑性和机械强度,能根据需要预先制成一定的形状, 直接填充骨缺损部位, 避免了传统手术骨移植带来的巨大痛苦及并发症,因而设计此实验，实验结果X线拍片与组织学观察显示,这种方法所构建的复合材料明显加速了骨修复进程,具有良好的成骨活性，作为骨缺损的修复材料、提供了有力的实验依据，为口腔颌面外科颌骨缺损的治疗开辟一个有效的途径。

　　【参考文献】

　　[1]Sato-S，Koshino-T，Saito-T.Osteogenie response of rabbit tibia toHydroxyapatite Partiele-Plaster of Paris mixture[J].Biomaterials，1998，19(20):18951900

　　[2]Bianeo-P，Riminucci-M，Kuznetsov-S，et al.MultiPotentialcells inthe bone marrow stroma: regulation in the context of organPhysiology[J].Crit Rev Eukaryot Gene ExPr，1999，9(2):159173

　　[3]郑有华，任才年.自体骨髓复合移植的研究进展[J].口腔颌面外科学杂志，1995,5(2):98100

　　[4]Friedenstein AJ.0steogenic stem cells in the bone marrow[J].BoneAnd Mineral Research，1990，7:243

　　[5]孙培锋，张喜善，王信胜,等.自体成骨细胞与脱钙骨复合移植修复兔桡骨缺损的实验研究[J].中国骨与关节损伤杂志，2005,20(11):749

　　[6]司徒镇强, 吴军正主编.细胞培养[M].西安:世界图书出社,2000，181

　　[7]王德超，李奎，崔冰，等.去抗原异种松质骨复合骨髓基质干细胞修复骨缺损[J].生物骨科材料与临床研究，2009，6(1):911

　　[8]Ripamonti U,Duneas N.Tissue engineering of bone by osteoinductive biomaterials[J].MRS Bulletin,1996,21(11):3639