高原低氧对健康人体内磺胺甲噁唑的蛋白和红细胞结合率的影响

　　【摘要】 　　目的 观测高原低氧对健康人体内磺胺甲噁唑的蛋白和红细胞结合率的影响。 方法 取平原和高原地区健康男性志愿者口服磺胺甲噁唑后1.5、12和48 h时间点血样，抗凝，一半保留全血，另一半分离血浆，超率法测定蛋白结合率，红细胞结合率用红细胞压积、血浆和全血药物浓度计算。药物浓度均采用反相高效液相色谱法测定。 结果 平原健康男性志愿者体内磺胺甲噁唑的蛋白和红细胞结合率分别为65.31%和5.96%，高原健康男性志愿者体内磺胺甲噁唑的蛋白和红细胞结合率分别为69.60%和9.41%，高原健康男性志愿者体内磺胺甲噁唑的蛋白和红细胞结合率显著高于平原健康男性志愿者。 结论 高原低氧使健康人体内磺胺甲噁唑的蛋白和红细胞结合率均显著升高。

　　【关键词】 高原低氧 磺胺甲噁唑 蛋白结合率 红细胞结合率 高效液相色谱

　　EFFECT OF HIGH ALTITUDE HYPOXIA ON THE　PROTEIN AND RED BLOOD CELLS BINDING TO SULFAMETHOXAZOLE IN HEALTHY VOLUNTEERS

　　Li Xiangyang, Zhu Junbo，Ge Rili

　　(1. Department of Pharmacy, Qinghai University Medical College; 2.Research Center of Hign Altitude Medicine, Qinghai University Medical College)

　　Abstract Objective To study the effect of high altitude hypoxia on the binding of protein and red blood cells of sulfamethoxazole in healthy volunteers. Methods 1.5、12 and 48 h after volunteers living at plain and high altitude were administrated orally cotrimoxazole tablets, the blood sample was collected in order to obtain whole blood and plasma samples. Protein binding was determined by ultrafiltration method, and RBC binding was calculated with hematocrit, whole blood and plasma concentration. The concentration of sulfamethoxazole in biological sample was determined by RP-HPLC method. Results The protein and RBC binding of sulfamethoxazole in healthy volunteers living at plain were 65.31% and 5.96%, respectively, and The protein and RBC binding of sulfamethoxazole in healthy volunteers living at high altitude were 69.60% and 9.41%, respectively. The protein and RBC binding of sulfamethoxazole in healthy volunteers living at high altitude were significantly higher than healthy volunteers living at plain. Conclusion The effect of high altitude hypoxia on the protein and RBC binding of sulfamethoxazole in healthy volunteers was significant.

　　Key words High altitude Sulfamethoxazole Protein binding RBC binding HPLC

　　机体从平原进入高原地区后，高原特殊自然条件使机体产生一系列的病理、生理、生化改变，甚至解剖组织学的变化。机体的这种对外界环境代偿性与失代偿性调节反应与药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄的变化存在一定关系。磺胺甲噁唑为中效合成磺胺类药物，抗菌谱广，临床可用于急慢性尿路感染、脑膜炎、呼吸道感染等的预防和治疗[1]，长期使用可引起过敏、恶心、呕吐及肝毒性、血液学毒性和皮肤粘膜眼综合征等不良反应[2]。磺胺甲噁唑是高原地区防治呼吸道感染等疾病的常用药物之一，蛋白结合率为60%～80%，体内主要被N-乙酰基转移酶2(NAT2)代谢为N4–乙酰磺胺甲噁唑后排出体外，其余以葡萄糖醛酸结合物形式经肾排泄[3,4]。作者曾对磺胺甲噁唑在平原和高原人体的药物动力学进行了研究[4,5]，本文采用反相高效液相色谱法测定平原和高原健康志愿者口服磺胺甲噁唑后的血浆药物浓度和全血药物浓度，探讨高原低氧对健康人体内磺胺甲噁唑的蛋白和红细胞结合率的影响，为高原地区磺胺甲噁唑的临床合理使用提供一定的参考依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器及试药

　　高效液相色谱仪LC-10AT泵和SPD-10A 紫外检测器(日本岛津);N2000型色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所);XW-80A旋涡混合器(上海精科有限公司);TGL-16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂);Microcon离心超滤管(Millipore,USA)。磺胺甲噁唑对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号：100025-199503)。甲醇、乙腈为色谱纯;其余试剂为分析纯;水为纯净水。

　　1.2 方法

　　1.2.1 色谱条件及色谱行为：流动相为乙腈-水-冰乙酸-三乙胺 (38:62:0.4:0.3, v/v)，色谱柱为Lichrospher C18 ( 250 mm×4.6 mm，5μm)，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为240 nm;进样量10 μL。在此色谱条件下，磺胺甲噁唑峰形良好，出峰时间为5.7 min，无杂峰干扰，基线平稳(图1)。

　　1.2.2 对照品溶液的配制：精密称取10 mg磺胺甲噁唑，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 mg·mL-1磺胺甲噁唑的贮备液。取此液1 mL置10 mL量瓶中，加入甲醇定容，即得100 μg·mL-1磺胺甲噁唑甲醇溶液;依次稀释成10、1 μg·mL-1的溶液。

　　1.2.3 样品处理：于离心管中精密加入0.5 mL血浆样品，涡旋，加入0.15 mL 30%高氯酸，涡旋1 min，离心10 min(1.6×104 r·min-1)，分取上清液，精密吸取10 μL进样分析。

　　1.2.4 标准曲线的制备及最低可定量浓度测定：取离心管数支，分别精密加入不同量的磺胺甲噁唑对照液后以氮气流吹干，加入0.5 mL空白血浆，涡旋1 min，配成分别含磺胺甲噁唑为1、5、10、20、40、80、120、160 μg·mL-1的标准血浆样品，按“1.2.3”项下所示方法操作，每种浓度做5份样品，记录色谱图，计算磺胺甲噁唑峰面积，以平均峰面积对血药浓度进行回归计算，得回归方程为：A = 7.768×103C -1.584×103(r = 0.9998)。按“1.2.1”项条件测得磺胺甲噁唑在血浆中的最低定量浓度为1 μg·mL-1。

　　1.2.5 回收率及精密度：取“1.2.4”项下配制的低、中、高浓度的标准血浆(磺胺甲噁唑浓度为1、40、160 μg·mL-1)，按“1.2.3”项下所示方法离心并进样分析，峰面积代入回归方程计算测得浓度，再与理论浓度相比计算方法回收率(n = 5);同日和连续5 d各处理5份样品，求得日内RSD和日间RSD。结果3种浓度磺胺甲噁唑的平均回收率分别为106.02%、95.92%、105.65%;平均日内RSD分别为6.83%、1.10%、0.91%;平均日间RSD分别为6.09%、2.90%、2.12%。

　　1.2.6 稳定性试验：按“1.2.4”项下所示方法配制低、中、高浓度的标准血浆样品(磺胺甲噁唑浓度分别为1、40、160 μg·mL-1)各6份，分别室温放置0、1、3、8 h和冷冻0.25、0.5、1、7、14、21 d后自然解冻。按“1.2.3”项下所示方法操作，测定峰面积，计算得3种浓度血浆样品的RSD为9.44%、6.78%和4.12%。

　　1.2.7 志愿者及实验方案：10名平原地区健康男性汉族受试志愿者均为陕西省咸阳市(海拔400 m)在校学生，平均年龄20.6±1.3岁(19 ～ 24岁)，平均身高172.3±4.7 cm(163～180 cm)，平均体重64.1±6.0 kg(56～75 kg);10名高原地区健康男性汉族受试志愿者均为四川省来青海省务工人员，在果洛州(海拔3780 m)生活工作1～3年，平均年龄21.2±1.3岁(19～24岁)，平均身高172.7±5.4 cm(162～183 cm)，平均体重62.7±8.0 kg(50～75 kg)。志愿者受试前在医院接受全面体格检查并签署知情同意书，并要求无既往病史、不良嗜好、药物过敏史和试验前2 周内未服用任何药物。志愿者试验前禁食过夜至少10 h(不禁水)，于次日早晨7:00空腹服用复方新诺明3片(含磺胺甲噁唑1200mg)，用150～200 mL温开水送服，服药后于1.5、12.0、48.0 h静脉采血5 mL于肝素试管中，一半保留全血，另一半分离出血浆，-4 ℃保存待测。

　　1.2.8 蛋白结合率测定：取平原和高原健康男性志愿者口服1 200 mg磺胺甲噁唑后1.5、12和48 h时间点血样，抗凝，分离血浆，按“1.2.3”建立的方法测定血浆中磺胺甲噁唑的浓度(Cp)。另取各时间点血浆约0.5 mL，加入Microcon离心超滤管(Millipore,USA)的上层，25 ℃条件下离心20 min(2.5×104 r·min-1)，取超滤液0.2 ml于离心管中，加入0.06 mL 30%高氯酸，然后按上述方法测定血浆超滤液中磺胺甲噁唑的游离浓度(Cw)。磺胺甲噁唑的血浆蛋白结合率(F)按下式计算：F = [(Cp – Cw )/ Cp] × 100% (Cp：血浆药物浓度;Cw：血浆超滤液药物浓度)。

　　1.2.9 红细胞结合率测定：取平原和高原健康男性志愿者口服1 200 mg磺胺甲噁唑后1.5、12和48 h时间点血样，抗凝，分成两等份，一部分保留全血，另一部分分离血浆，按“1.2.3” 建立的方法测定血浆中磺胺甲噁唑的浓度(Cp)。另取各时间点肝素抗凝全血0.5 mL，加入1 mol/L的NaOH溶液20 μL，旋涡混匀30 s使其溶血，加入0.13 mL 30%高氯酸，然后按上述建立的方法处理，测定全血中磺胺甲噁唑的浓度(Cb)。磺胺甲噁唑的红细胞结合率(CE)按下式计算：CE = [Cb–Cp (1–H)] /Cb × 100 (Cp：血浆药物浓度;Cb：全血药物浓度;H：红细胞压积)。

　　1.2.10 数据处理：采用SPSS13.0软件对平原和高原健康男性志愿者口服1200 mg磺胺甲噁唑后磺胺甲噁唑与血浆蛋白、红细胞的结合率进行统计分析，组间比较应用方差分析，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　平原和高原健康男性志愿者体内磺胺甲噁唑与血浆蛋白和红细胞的结合率见表1～2。表1平原和高原健康男性志愿者体内磺胺甲噁唑与血浆蛋白的结合率，表2平原和高原健康男性志愿者体内磺胺甲噁唑与红细胞的结合率(略)。

　　表1～2显示，平原和高原健康男性志愿者体内磺胺甲噁唑与血浆蛋白的结合率分别为65.31%和69.60%，平原和高原健康男性志愿者体内磺胺甲噁唑与红细胞的结合率分别为5.96%和9.41%，经统计分析，高原健康男性志愿者体内磺胺甲噁唑与血浆蛋白和红细胞的结合率均显著高于平原健康男性志愿者，提示高原低氧对健康人体内磺胺甲噁唑与血浆蛋白和红细胞的结合率有显著影响。

　　3 讨论

　　高原低氧对药物血浆蛋白结合率的影响，文献有少量报道，Arancibia等发现志愿者急进高原或久居高原后泼尼松龙的血浆蛋白结合率均显著升高 [6]，与本研究结果相似。但也有研究发现进入高原后哌替啶 [7]和呋塞米 [8]的血浆蛋白结合率反而下降。高原低氧环境引起的机体生理学的变化是极其复杂的，这方面的研究还有待进一步探索。

　　文献报道磺胺甲噁唑与红细胞的结合率为9.0% [9]。本研究发现平原和高原健康志愿体内磺胺甲噁唑的红细胞结合率分别为5.96%和9.41%，高原健康志愿者比平原健康志愿者结合率高36.7%。

　　血浆蛋白和红细胞结合率的升高，使游离型磺胺甲噁唑的浓度降低、结合型磺胺甲噁唑的浓度升高，致磺胺甲噁唑的体内消除减慢。此结论与文献报道 [4]结果一致。

　　【参考文献】

　　[1]徐叔云. 现代实用临床药理学[M]. 北京: 华夏出版社, 1996： 989-990

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　　[3]Masters PA, O'Bryan TA, Zurlo J, et al. Trimethoprim-sulfamethoxazole revisited[J]. Arch Intern Med， 2003, 163 (4): 402-410

　　[4]Li XY, Gao F, Li ZQ, et al. Comparison of the Pharmacokinetics of Sulfamethoxazole in Male Chinese Volunteers at Low Altitude and Acute Exposure to High Altitude Versus Subjects Living Chronically at High Altitude: An Open-Labeled, Controlled, Prospective Study[J]. Clin Ther, 2009, 31 (11): 2744-2754

　　[5]李向阳, 冯伟力, 程会云, 等. 磺胺甲噁唑及其代谢产物在健康人体内的药物动力学研究[J]. 华西药学杂志，2010，25 (1): 43-45

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　　[7]Ritschel WA, Paulos C, Arancibia A, et al. Pharmacokinetics of meperidine in healthy volunteers after short-and long- term exposure to high altitude[J]. J Clin Pharm, 1996, 36 (7): 610-616

　　[8]Arancibia A, Nella Gai M, Paulos C, et al. Effects of high altitude exposure on