L.casei Zhang PG对鸡新城疫疫苗

　　【摘要】 　　目的 了解干酪乳杆菌(L.casei Zhang)肽聚糖( peptidoglycan, PG)作为新城疫疫苗佐剂对免疫鸡血清中HI抗体、IgG及T淋巴细胞转化率的影响。方法 把L.casei Zhang PG作为佐剂和弗氏完全佐剂分别添加到鸡新城疫疫苗里，制成L.casei Zhang PG佐剂鸡新城疫疫苗和弗氏完全佐剂鸡新城疫疫苗后，分别使小鸡致免;二免后每周采样，连续采6周后检测其血清中的HI抗体效价、IgG含量以及鸡脾脏中T淋巴细胞的转化率。结果 L.casei Zhang PG佐剂组鸡血清中HI抗体效价、IgG含量均显著提高，鸡脾脏中T淋巴细胞转化率也明显提高。结论 L.casei Zhang PG是鸡新城疫疫苗的良好佐剂。

　　【关键词】 L.casei Zhang 肽聚糖 佐剂 鸡新城疫疫苗

　　SYNERGISTIC IMMUNE EFFECT OF L.CASEI ZHANG　PEPIDOGLYCAN ON NEWCASTLE DISEASE VACCINE

　　Shuang Jie, Yong Sheng, Bao jinxue,Zhang Qijin

　　(1.Qinghai University Medical couege;2. College of Veterinary Science and Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Huhehaote, Inner Mongolia)

　　Abstract Objective To investigate whether the peptidoglycan of L.casei Zhang as an adjuvant of Newcastle Disease Vaccine shows antibody enhancing effect or influence the transformation rate of T lymphocytes in immunized chicken. Methods Taken peptidoglycan of L.casei Zhang as adjuvant or as Freund's complete adjuvant adding into the emulsion of Newcastle Disease Vaccine and immunize the chicken respectively. After secondary immunization, phlebotomized blood each week and continued for eight weeks. Serum HI antibody titer, IgG contents and T lymphocyte transformation rate in chicken spleen were detected. Results The HI antibody titer, the rate of lymphocyte transformation and the concentration of IgG in experimental group were significantly higher than those in control group. But there was no significant difference in adjuvant added group except lymphocyte transformation rate. Conclusion L.casei Zhang peptidogly can is a good adjuvant for Newcastle disease vaccine.

　　Key words L.casei Zhang Peptidoglycan Adjuvant Newcastle disease vaccine

　　干酪乳杆菌是人体主要的益生菌，在体内具有维持正常菌群生态平衡，抑制有害菌繁殖，提高免疫力，预防肿瘤发生等多种生物学功能，有潜在预防和治疗疾病作用[1]。其细胞壁中的肽聚糖(PG)是人类免疫系统的激活剂[2]，宿主可以通过识别PG结构，对入侵细菌作出相应的免疫应答[3]。天然免疫系统中存有一系列模式识别受体(PRR)，可以识别入侵细菌的PG等病原体相关分子模式(PAMPs)[4]，通过不同的信号传导途径释放相同的免疫调控物质，如IL、TNF-α等多种细胞因子，在抵抗入侵病原体中发挥免疫功能[5]。本文将从内蒙古酸马奶中分离出的耐胆盐和耐酸生长特性的L.casei Zhang PG与鸡新城疫疫苗联合使用,使小鸡致免。用血凝抑制试验和间接ELISA试验检测鸡血清中HI抗体效价和IgG含量;用MTT法检测鸡脾脏T淋巴细胞的转化率，观察L.casei Zhang PG的免疫协同作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 乳酸菌菌株

　　L.casei Zhang 由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室分离提供。

　　1.1.2 试验动物与饲料

　　1日龄的迪卡雏鸡购自内蒙古畜牧科学院种鸡场;中、小鸡颗粒饲料购自内蒙古正大公司。

　　1.1.3 疫苗及抗原

　　鸡新城疫油乳剂灭活苗(批号s48002)购自内蒙古金宇集团生物制药厂;新城疫抗原(ND)由内蒙古自治区兽医站提供。

　　1.1.4 试剂

　　刀豆球蛋白(ConA)、噻唑蓝(MTT)、 弗氏完全佐剂(FCA)、二甲基亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、3,3′,5,5′-四甲替联苯胺(TMB)、鸡免疫球蛋白G定量ELISA试剂盒(Chicken IgG ELISA quantitation kit)为Sigma产品。人淋巴细胞分离液购于天津洋生物制品科技有限责任公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 L.casei Zhang PG 的制备

　　先将L.casei Zhang菌种在脱脂乳培养基中活化3次，再接种于MRS培养液中增菌培养(37℃，48h)，离心(2000rpm，10min)收集菌体;将菌体悬浮于蒸馏水中，超声处理(20 min，3次)，上清液差速离心(1000rpm，15min;10000rpm，20min)收集粗细胞壁;取适量粗细胞壁加SDS溶液离心(10000rpm，20 min)，收集粗肽聚糖;将SDS处理过的粗细胞壁洗净后溶于胰蛋白酶缓冲液(pH 7.5)中，37 ℃水浴振荡20 h，离心(10000rpm，20min)获得酶处理粗细胞壁，用无水乙醇脱水;将酶处理沉淀物悬浮在三氯乙酸溶液(10g/dL)中去除共价结合的磷壁酸，离心(10000rpm，20min)蒸馏水洗涤3次，用无水乙醇脱水干燥，备用。具体步骤见参考文献[6] 。

　　1.2.2 L.casei Zhang PG佐剂鸡新城疫疫苗的制备

　　把L.casei Zhang PG按所需剂量称取，与鸡新城疫疫苗在乳钵中研磨混匀，最终制成L.casei Zhang PG含量为200 μg/ml的油包水型制剂，4℃保存备用。

　　1.2.3 弗氏完全佐剂鸡新城疫疫苗的制备

　　把弗氏完全佐剂与鸡新城疫疫苗按1:1比例在乳钵中研磨混匀，最终制成油包水型制剂，4 ℃保存备用。

　　1.2.4 分组及剂量

　　将1日龄的雏鸡120只随机分成4组，每组30只。15日龄时行首免，首免两周后加强免疫。按常规方法饲养。空白组(Ⅰ组)予生理盐水(0.5mL/只);对照组(Ⅱ组)予新城疫油乳剂灭活苗(0.5 mL/只);L.casei Zhang PG佐剂组(Ⅲ组)予新城疫油乳剂灭活苗(0.5 mL/只)，其中含L.casei Zhang PG 100 μg);弗氏完全佐剂组(Ⅳ组)予新城疫油乳剂灭活苗和弗氏佐剂(比例为1:1 ，0.5 mL/只)。

　　1.2.5 HI抗体效价及T淋巴细胞转化率的检测

　　二次致免后每周每组取3只，翅静脉采血分离血清，参照文献[7]方法进行HI抗体效价检测。分离血清之后，颈动脉放血处死，参照文献[8] 方法行T淋巴细胞转化率试验。

　　1.2.6 IgG含量检测

　　参照试剂盒推荐方法进行，用包被液将一抗稀释到所需的浓度，每孔加100 μL，加盖置4 ℃过夜，次日倾去孔内液体用冲洗液洗3次，最后一次拍干;再于每孔加200 μL封闭液，加盖温浴(37℃，30 min)，倾去孔内液体，洗涤3次;加入稀释好的待检血清100 μL，盖好，温浴(37℃，1h)，洗涤5次;用洗涤液将酶标二抗稀释到所需的浓度，每孔加100 μL，温浴(37℃，1h)，洗涤5次，最后拍干;每孔加入TMB底物显色液100 μL，反应板置室温暗处观察，当显蓝色时及时终止反应;每孔加入50 μL / M硫酸反应孔内蓝变黄，稳定3～5 min后用酶标仪(450 nm)测定每孔OD值。

　　1.2.7 统计学处理方法

　　采用SPSS11.0软件对各试验数据进行处理，结果以x±S表示，HI平均抗体效价采用几何均数计算，各组间比较采取单因素方差分析，显著性检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 不同佐剂鸡新城疫疫苗免疫雏鸡后对HI抗体效价的影响(表1)

　　表1不同佐剂疫苗免疫雏鸡后对HI抗体效价的影响(略)

　　表1显示，随着免疫时间的延长，对照组与空白组相比存在显著差异(P<0.05)。添加佐剂以后，随着时间的延长，HI抗体效价明显提高，与对照组相比，各时间段加L.casei Zhang PG组和加弗氏完全佐剂组存在显著差异(P<0.05)。L.casei Zhang PG佐剂组与弗氏完全佐剂组比较，第5～6 w存在显著差异(P<0.05)。

　　2.2 不同佐剂鸡新城疫苗免疫后对鸡脾脏T淋巴细胞的影响(表2)

　　表2　不同佐剂免疫后对鸡脾脏T淋巴细胞的影响(略)

　　表2显示，各时间段对照组与空白组比较存在显著差异(P<0.05)。随着免疫时间的延长，鸡脾脏T淋巴细胞转化率显著提高;与对照组相比加佐剂各组鸡脾脏T淋巴细胞转化率存在显著差异(P<0.05)。L.casei Zhang PG佐剂组与弗氏完全佐剂组比较存在显著差异(P<0.05)。

　　2.3 不同佐剂鸡新城疫疫苗免疫后对鸡血清中IgG含量的影响(表3)

　　表3　不同佐剂免疫后对鸡血清中IgG含量的影响(略)

　　表3显示，对照组与空白组中的OD值相比存在显著差异(P<0.05)。加佐剂各组与对照组相比存在显著差异(P<0.05)。L.casei Zhang PG佐剂组与弗氏完全佐剂组比较，OD值无明显差异(P>0.05)。

　　3 讨论

　　血清中IgG含量是机体免疫器官组织中的体液免疫活性细胞产生的体液免疫分子在血液中的体现，是体液免疫系统功能状态的重要指标。因此本研究主要检测了血清IgG含量。结果发现，对照组(鸡新城疫油苗免疫组)在第3～4 w内OD值维持较高水平，到第5 w开始下降，相比之下，加L.casei Zhang PG佐剂组者在第2～5 w维持较高水平，到第6 w开始有所下降，但第6 w仍显著高于对照组，说明L.casei Zhang PG 提高了免疫反应的速度，增加了持久性，发挥了免疫增强作用;L.casei Zhang PG佐剂组鸡血清中IgG含量略高于弗氏完全佐剂组，说明L.casei Zhang PG佐剂免疫增强作用已达到或略高于弗氏完全佐剂的水平。同时，检测鸡血清中HI抗体效价发现，对照组(鸡新城疫疫苗免疫组)到第4 w抗体效价达到最高峰值;而L.casei Zhang PG佐剂组到第5w抗体效价达到最高峰值，到第6 w仍维持高抗体水平;说明L.casei Zhang PG有增强B细胞对抗原刺激的反应性作用，增加了血清中特异性抗体效价，使免疫应答能力增强。

　　外周血液T细胞数量和功能变化是胸腺、脾脏等免疫组织结构功能变化在外周血液的反映，是机体细胞免疫机能状态的重要标志。同时，T细胞在免疫调节中也具有重要作用。本研究发现，用L.casei Zhang PG刺激后，鸡外周血液T淋巴细胞数量和T淋巴细胞增殖反应明显高于空白组和鸡新城疫疫苗免疫组，说明L.casei Zhang PG促进了细胞免疫发育，提高了机体全身细胞免疫水平。

　　综上所述，L.casei Zhang PG与鸡新城疫疫苗联用在较低浓度下即能刺激机体产生较强的免疫反应，能增强机体相应的体液免疫应答和细胞免疫应答,具备良好的免疫佐剂效应。并且L.casei Zhang PG是益生菌的菌体成分，进入体内可自行降解且易于从体内清除。

　　【参考文献】

　　[1]姜国湖，董全江.干酪乳杆菌对免疫效应细胞杀伤作用影响的研究[J].医学检验与临床，2008，19(5)：40-43

　　[2] Dominique Mengin-Lecreulx, Bruno Lemaitre. Structure and met- abolism of peptidoglycan and molecular requirements allowing its detection by the Drosophila innate immune system[J]. J Endotoxin Res, 2005,11(2):105-111

　　[3]吕成伟， 陈政良. 肽聚糖识别蛋白[J]. 免疫学杂志，2002，27(3)：78-80

　　[4]王静华，赵洪涛，汪以真，等.细菌细胞壁肽聚糖的研究进展[J]. 中国兽药杂志，2004，38(1):38-40

　　[5]R. Dziarski. Review: Recognition of bacterial peptidoglycan by the innate immune system[J]. Cell Mol Life Sci, 2003,60:1793-1804

　　[6] 双杰，宋新宇，张七斤，等.乳酸杆菌肽聚糖对鸡新城疫油苗和禽流感油苗的免疫增强作用的研究[J].畜牧与饲料科学(畜牧篇)，2008，125(2)：41-43

　　[7] 杨云裳，薛飞群.抗生素饲料添加剂研究概况[J].中兽医医药杂志，2000，5：38-39