转染人白介素-10基因对未成熟心肌缺血再灌注损伤的影响

　　【摘要】 目的：观察转染人白细胞介素10(hIL-10)基因对未成熟心肌缺血再灌注(IR)的影响并探讨其可能作用机制。方法：24只3～4周龄的幼兔被随机分为空白对照组、空载对照组和基因转染组, 每组8只。以阻断左冠左室支30 min再开放120 min，建立IR动物模型;阻断前经左室内注射重组腺病毒转染hIL-10。结果：IR后，空载对照组的血流动力学各项指标恢复率明显差于空白对照组(P均<0.05)，基因转染组的各项指标明显优于空载对照组(P<0.05);与空白对照组比较，空载对照组和基因转染组的丙二醛(MDA)含量[(6.33±1.03) μmol/g wet∶( 14.35±1.28) μmol/g wet∶( 8.78±1.22) μmol/g wet]和髓过氧化物酶(MPO)活性[(5.42±0.72) U/g wet∶( 19.35±2.32) U/g wet∶( 9.26±1.26) U/g wet]明显升高(P均<0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)活性明显下降 [( 215.25±26.65) U/g wet∶( 93.82±12.61) U/g wet∶(176.33±19.84) U/g wet, P均<0.05];与空载对照组比较，基因转染组的MDA含量和MPO活性明显下降，SOD活性明显升高(P均<0.05)。结论：经左室内注射重组腺病毒载体介导hIL-10转基因有效可行，可减轻未成熟心肌缺血再灌注损伤。

　　【关键词】 心肌;基因;白细胞介素10;再灌注损伤

　　Effect of gene transfer of human interleukin-10 on ischemia reperfusion injury in immature myocardium/CHEN yi, CHEN Liangwan// Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou, Fujian 350001, China

　　Abstract: Objective：To investigate the effect of adenovirusmediated gene transfer of human interleukin-10 on immature myocardium after regional myocardial ischemiareperfusion, and discuss the mechanisms. Methods：Twenty-four immature rabbits were randomly divided into three groups (8 animals/group): group A(control group), group B(no receiving adenovechIL-10 complex), group C(adenovirusmediated gene transfer of human interleukin-10 was injected into left ventricles before ischemia). Left coronary artery was temporarily occluded for 30 min, followed by 120 min reperfusion for astabish IR mode. The transgene expression of hIL-10 was detected by means of immunohistochemistry. Result：After IR, the indexes of hemodynamics of group B were significantly worse than those of group A(P<0.05 all), those of group C were better than those of group B(P<0.05). Compared with group A, the level of malonyl diadehyde(MDA)[(6.33±1.03) μmol/g wet vs.( 14.35±1.28) μmol/g wet vs. ( 8.78±1.22) μmol/g wet], myeloperoxidase(MPO)[(5.42±0.72) U/g wet vs. ( 19.35±2.32) U/g wet vs. ( 9.26±1.26) U/g wet ] significantly increased , superoxide dismutase (SOD)[( 215.25±26.65) U/g wet vs. ( 93.82±12.61) U/g wet vs. (176.33±19.84) U/g wet significantly decreased ], P<0.05 all in group B, group C. Compared with group B, the content of MDA, and activity of MPO significantly decreased, the SOD activity significantly increased in group C, P<0.05 all. Conclusions: Adenovirusmediated gene transfer of human interleukin-10 in immature myocardium may ameliorates regional ischemiareperfusion injury.

　　Key words: Myocardium; Gene; Interleukin-10; Reperfusion injury

　　我国先天性心脏病发生率为18.53/万，列住院出生缺陷发生率首位，越来越多先心患儿进行早期手术治疗，而绝大多心外手术需要心脏停搏， 缺血再灌注损伤(IRI)难以避免，防治心肌IRI是心肌保护的核心。本研究以阻断左冠左室支30 min，再灌注120 min的幼兔为心肌IR动物模型。通过左室内注射人白细胞介素(hIL)-10为目的基因的重组腺病毒，对幼兔心肌进行在体基因修饰预处理，观察转染的可行性及其对心肌IRI的影响,并探讨其可能作用机理。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　(1)实验动物：24只健康新西兰白兔，3～4周龄，雌雄不拘，(420±30)g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限公司;(2)主要药品、试剂及器械：编码hIL-10的重组腺病毒(AdenoVec-hIL-10)及腺病毒空白载体购自美国Invivogen公司;hIL-10单克隆抗体、免疫组化SABC染色试剂盒、3，3′二氨基联苯(DAB)酶底物显色试剂盒购自武汉博士德(Boster)生物工程有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;多道生理信号采集系统(RB6240B型)购自成都仪器厂;(3)腺病毒载体：AdenoVec-hIL-10是一种Pac I线性腺病毒质粒，可直接转染人胚肾细胞(E1 complementing cell line,293)，生成5型复制缺陷重组腺病毒。扩增后腺病毒溶液病毒颗粒滴度用半数组织培养感染量法滴定。本实验腺病毒颗粒的最终滴度为5.0×1010PFU/ml[PFU：空(噬菌)斑形成单位]。

　　1.2 方法

　　(1)实验分组：A：空白对照组(n=8)，经左室内注射注入生理盐水，冠脉穿线套管但不阻断;B：空载对照组(n=8)，经左室内注射注入空载腺病毒，阻断左冠左室支30 min，再灌注120 min;C：基因转染组(n=8)，经左室内注射注入携hIL-10基因的重组腺病毒载体，阻断左冠左室支30 min，再灌注120 min;(2)实验模型：参考Saeed[1]和张嘉宁[2]的“套管拉线法” 结扎左冠状动脉的左室支(LVA)中部制备IR模型。同时穿刺颈总动脉置入导管，监护下将导管送入主动脉瓣口约2mm至左心室，连接多道生理信号采集系统，同步监测肢体Ⅱ导联心电图。模型的具体操作：阻断LVA30 min后开放再灌注120 min。肉眼可见阻断后左心室心尖部由红色变暗，说明缺血形成，以收紧结扎线后心电图上S-T段抬高≥1mV，开始计时;再灌注时心尖部由暗红色渐变为红色，S-T下移>1/2以上为再灌注成功。稳定时心电图不正常，或不到观察终点死亡，以不成功的模型弃去;(3)基因转染：用注射器抽取含重组腺病毒载体5.0×1010PFU的生理盐水1ml，经左心室导管注入，注射时间10秒左右，注射时应用血管夹同时夹住升主动脉、肺动脉，15秒后放开;空载对照组注射含5.0×1010PFU空载腺病毒颗粒的生理盐水1ml;空白对照组注射生理盐水1ml。

　　1.3 观察指标及测定方法

　　(1)血流动力学：经左心室内导管连接压力换能器及多道生理信号采集系统，测定左心室内压，待心电图平稳后，在阻断冠脉前，同步记录平均动脉压(MAP)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室压最大上升速率及下降速率(+dp/dt max、-dp/dt max)，重复测取3次，取平均值作为测定结果并计算左室形成压(LVDP=LVSP-LVEDP)，以上作为基础值。并把IR后的相应测定值除以基础值取得恢复率;(2)MDA含量、SOD和MPO活性测定：实验结束后，取左室缺血区约0.5g心肌组织，用硫代巴比妥酸法测定MDA，黄嘌呤氧化定量法检测SOD活性，化学比色法测定MPO，测定严格按试剂盒说明书操作;(3)病理组织学检测：实验结束后，取左室缺血区心肌进行固定、包埋、切片和HE染色，光镜观察心肌结构;(4)SABC法免疫组化染色检测左室缺血区心肌组织hIL-10的表达位置及强度，光学显微镜下观察阳性细胞为棕褐色(DAB染色)。

　　1.4 统计学处理

　　实验数据应用SPSS 11.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 血流动力学各项指标基础值

　　血流动力学基础值组间差异无显著性(P>0.05)，见表1。

　　2.2 各组IR后各项指标恢复率比较

　　空载对照组的各项指标恢复率明显差于空白对照组(P<0.05)，说明IR导致心功能下降;基因转染组的各项指标明显优于空载对照组(P<0.05)，见表2。

　　2.3 各组心肌MDA含量、SOD及MPO活性

　　与空白对照组比较，空载对照组和基因转染组的MDA含量和MPO活性明显升高，SOD活性下降(P均<0.05);与空载对照组比较，基因转染组的MDA含量和MPO活性下降，SOD活性升高(P<0.05)，见表3。表1 各组血流动力学基础指标表2 各组缺血再灌注后心功能指标比较表3 各组心肌MDA含量、SOD及MPO活性

　　2.4 心肌组织hIL-10的表达位置及强度

　　表达部位主要位于心肌细胞及血管内皮细胞，部分位于浸润的炎症细胞。阳性信号主要位于细胞浆，呈棕褐色。空白对照组及空载对照组未见明显阳性信号表达(图1，见封四)。

　　2.5 病理组织学观察

　　空载对照组可见心肌间质水肿、出血，血管内皮受损有细胞脱落，出现炎症细胞浸润;与空载对照组比较，基因转染组的心肌间质水肿、出血明显减轻，炎症细胞浸润少(图2，见封四)。

　　3 讨 论

　　1989年美国DNAX研究所Fiorentino等发现并于同年命名的IL-10是细胞因子网络中为数不多的抑制性细胞因子，它可调节抑制炎性因子的合成与释放，直接抑制炎症细胞的激活、迁移与粘附。IL-10可在损伤组织中减轻炎症，有利于重建体内炎症介质及抗炎介质的平衡。其在治疗炎症性损害中显示出广阔的应用前景。国外2期临床试验己显示它可能是继糖皮质激素之后的另外一种重要的抗炎物质[3，4]。

　　未成熟心肌的IRI具有多因素参与的复杂机制。心肌IRI是多细胞因子及炎症介质参与的非免疫性炎症损伤过程[5]。IR启动的多细胞因子参与的炎症反应是最重要的损伤机制之一。炎性细胞因子通过激活中性粒细胞(PMN)等效应细胞，产生效应物，造成细胞、组织、器官的损伤。在心肌IRI中， PMN与氧自由基导致的损伤是两个重要方面。PMN是IRI的主要效应细胞，PMN的浸润程度可用MPO的活性来表示。生物膜脂质过氧化是血管内皮损伤的基础，MDA可反映心肌组织脂质过氧化程度。SOD是机体重要的细胞内源性氧自由基清除剂。所以心肌组织中MDA含量和SOD活性可以判定IR后心肌的氧化和抗氧化能力，也可反映心肌组织IRI严重程度[6]。本实验研究中发现：与空白对照组比较，IRI明显的空载组未成熟心肌MDA含量、MPO活性明显升高，SOD活性明显降低，既证实了未成熟心肌IRI时血管内皮细胞脂质过氧化的发生，也证实了PMN的参与是导致IRI的原因之一。同时，转染组上述指标优于空载对照组，提示转基因通过某些机制影响了上述过程。由本实验结果推测：腺病毒介导hIL-10转基因使心肌组织局部产生抗炎细胞因子hIL-10，抑制了IRI效应细胞PMN的激活、迁移与粘附，减少了其浸润，结果MPO活性明显降低，产生的超氧化离子减少，生物膜脂质过氧化反应减轻，MDA含量减少，SOD活性提高。故病理结果表现为基因转染组的心肌水肿、出血、血管内皮细胞损伤、炎症细胞浸润等损伤减轻。基因转染组心肌结构损伤的减轻在心肌功能上得到体现，即其血流动力学指标表现优于空载组。本研究只观测了基因转染对IRI模型急性期影响，尚无法评价其远期效果，有待进一步研究。

　　随着在分子水平上对疾病认识的深入，基因治疗己成为医学领域中最重要的研究课题之一。IL-10的产生和消耗都不在心脏。本实验通过腺病毒介导，将hIL-10转基因至正常情况下不产生(或很少)IL-10的心脏，使心肌局部表达产生hIL-10，直接对抗同一局部的非免疫性炎症损伤，从抗炎角度，理论上比应用外源性重组蛋白，能更直接有效的达到保护心肌，防治IRI的目的，显示出其独特的优点。

　　本研究应用的AdenoVec-hIL-10为5型复制缺陷型腺病毒。其结构特点使其能感染靶细胞，但又不能在靶细胞内复制，从而避免腺病毒本身对靶细胞的损害，又达到基因转移的治疗目的。

　　基因治疗的关键问题在于将外源基因特异地导入靶组织或靶细胞内，并确保导入的基因能有效、稳定地表达出具有功能的蛋白质。腺病毒载体是基因转移治疗中转染效率最高的病毒载体[8]。腺病毒转染心脏途径主要有：静脉注射[9]、开胸心肌内直接注射、冠状动脉灌注、经针型导管(介入下)心肌内注射、开胸导入心包等。这些方法各有优缺点。本实验研究主要参考Hajjar的做法[10]，采取经左室内注射腺病毒载体，注射的同时夹住主、肺动脉15秒。免疫组化检测到心肌hIL-10产物的表达。结果表明经左室内注射腺病毒载体介导hIL-10转基因有效可行。

　　基因转染后，目的基因何时能在靶细胞表达以及表达持续时间值得关注。本研究结果从翻译水平证明，转染基因后未成熟心肌可在150min内即得到高效表达，这对及时预防和控制急性期IRI是非常重要的。腺病毒介导的外源基因在体内的转染表达一般可维持4～6周[11，12]。重复注入腺病毒载体不能延长转基因表达[13]。腺病毒转基因表达时程较短受多种因素影响，如何改进还是一个复杂的问题。但对于本研究所涉及的IRI来说，目的基因数周的暂时转染表达也许就足够了，并不需要治疗基因的长程表达，因而本研究的基因治疗策略相对安全。至于目的基因的表达到底能持续多久，有待进一步研究。

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