心肌营养素-1对血管紧张素II诱导心肌细胞肥大的影响

　　【摘要】 目的：研究心肌营养素-1(CT-1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大的影响。方法：利用AngⅡ刺激心肌细胞，导致细胞肥大，应用CT-1反义脱氧寡核苷酸进行干预。检测心肌细胞大小及3H-亮氨酸掺入率的变化;以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CT-1 mRNA及β-肌球蛋白重链(β-MHC) mRNA表达，免疫组织化学法检测心肌细胞CT-1蛋白的表达。 结果：经AngⅡ刺激后，在相差显微镜下可见心肌细胞面积变大，3H-亮氨酸掺入率、CT-1蛋白的表达增高;CT-1和β-MHC mRNA水平的表达增加。利用Fugene 6 可将CT-1反义脱氧寡核苷酸转染入心肌细胞。CT-1反义脱氧寡核苷酸组心肌细胞面积较肥大组明显减小[(81.257±3.995)mm2∶( 127.214±5.693) mm2]，3H-亮氨酸掺入量[(1653.33±17.91)cpm∶(1971.50±42.16) cpm]及CT-1蛋白[(3.16±0.17) %∶(3.51±0.29)%]明显减少;CT-1[(0.2137±0.0227)∶(0.4023±0.0160)]和β-MHC mRNA[(0.5032±0.0261)∶(0.773 4±0.0486)]表达亦显著减少(P<0.05～<0.01)。各指标Fugene 6组、错义组与肥大组无明显差异。结论：AngⅡ致心肌细胞肥大过程中伴有CT-1表达增加，应用CT-1反义脱氧寡核苷酸后可使之下降，说明CT-1参与了心肌细胞的肥大机制。

　　【关键词】 血管紧张素Ⅱ;心肌;寡脱氧核糖核苷酸类，反义

　　Effect of cardiotrophin-1 on hypertrophy of cardiocytes induced by angiotensin Ⅱ /YANG Shuang, YANG Kai , LU Ying, YU Bo//Department of Cardiology，Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin, 150086，China

　　Corresponding author：YU Bo，Email：ys4yy@yahoo.com.cn

　　Abstract：Objective: To study the effect of cardiotrophin-1 (CT-1) on hypertrophy of cardiocytes induced by angiotensin Ⅱ (AngⅡ). Methods: The cultured cardiocytes were treated with AngII to induce hypertrophy and given with CT-1 antisense oligodeoxyribonucleotide (ASODN). The cell size and 3H-leucine incorporation were examined. The mRNA levels of CT-1 and β-myosin heavy chain(β-MHC)were examined by realtime PCR method. The protein expressions of CT-1 were examined by immunohistochemistry method. Results: Stimulated by AngⅡ, the cardiocytes were enlarged under the contrast phase microscope. After stimulated by AngⅡ, 3H-leucine incorporation and the protein expression of CT-1 increased in the hypertrophic cardiocytes. The mRNA levels of CT-1 andβ-MHC increased also. Compared with hypertrophy group, the area of cardiocytes [( 127.214±5.693) mm2 vs.(81.257±3.995) mm2]，3H-leucine incorporation[(1971.50±42.16) cpm vs.(1653.33±17.91)cpm], protein expression of CT-1[(3.51±0.29)% vs.(3.16±0.17) %], CT-1 mRNA [(0.4023±0.0160) vs. (0.2137±0.0227)]and β-MHC mRNA[(0.773 4±0.0486)vs. (0.5032±0.0261)] significantly decreased in CT-1 ASODN group(given by CT-1 ASODN), P<0.05～<0.01. These indexes were no significantly difference among CT-1 MSODN (missence oligodeoxyribonucleotide)group,hypertrophy group and Fugene 6 group.Conclusion: Ang Ⅱ may induced the cardiocytes hypertrophy. The expression of CT-1 increased in hypertrophic cardiocytes stimulated by AngⅡ. The CT-1 ASODN inhibited the increased expression of CT-1 in hypertrophic cardiocytes stimulated by AngⅡ.

　　Key words：Angiotensin Ⅱ;Myocardium ; Oligonucleotides, antisense

　　心肌细胞肥大是心脏对多种病理刺激的代偿性反应，临床上许多疾病如高血压、心肌梗死，心力衰竭等都与心肌肥大密切相关[1]。该反应早期具有积极意义，最终导致心力衰竭和猝死，是临床上多种心血管疾病走向终末阶段的共同的病理生理过程。因此，对心肌细胞肥大发生发展分子机制的研究一直备受重视。目前，研究结果充分表明，多种神经体液因子如血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) [2，3]、内皮素1(ET-1)、去甲肾上腺素(norepinephrine)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等已被确认为心肌细胞肥大的诱导因素,它们通过激活各自的受体实现其相应的调控作用[4，5]。近年国外学者发现一个新的细胞因子：心肌营养素-1(CT-1)也能促心肌细胞肥大，但国内对其研究甚少。本实验利用AngⅡ引起心肌细胞肥大，采用Fugene 6转染CT-1反义脱氧寡核苷酸(Antisense oligonucleotides，ASODN)，观察心肌细胞肥大过程中CT-1的表达情况，以期对心肌细胞肥大的机制进行初步探讨。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料和试剂

　　血管紧张素Ⅱ(Sigma公司)，Fugene 6(Roche公司)， 3H-亮氨酸(中国原子能科学研究院同位素研究所)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM(Hyclone公司)。

　　1.2 转染液和Fugene6对照混合液的配制

　　按照Fugene 6转染试剂盒操作步骤完成。将 95μl无血清DMEM培养液、3μl Fugene 6以及反义寡核苷酸2μl(0.5μg/μl)轻轻混匀，室温孵育45 min，形成CT-1反义脱氧寡核苷酸转染液。同样比例配制错义脱氧寡核苷酸转染液。将97μl无血清DMEM培养液和3μl Fugene 6轻轻混匀，室温孵育45 min，作为Fugene 6对照组。

　　1.3 心肌细胞培养和分组

　　取出生48 h的Wister乳鼠，剪碎心室肌，0.25% 胰酶反复消化、取上清。收集各次消化的上清移入含有20%小牛血清的培养液中，离心后制备细胞悬液(1×108 /L)，按不同实验要求接种于培养瓶或培养板中，加入终浓度为0.1 mmol/L的Brdu，抑制成纤维细胞增殖。细胞分为5组：(1)对照组;(2)肥大组(AngII)组;(3)Fugene 6组;(4)反义组;(5)错义组。在细胞培养96 h后更换为无血清培养液，对照组每孔加入该培养液1 ml，其余各组每孔加入946 μl该培养液后，Fugene6组加入34μl Fugene 6对照混合液以及20 μl培养液;肥大组加入34μl培养液;反义组加入34 μl CT-1反义脱氧寡核苷酸转染液;错义组加入34 μl错义脱氧寡核苷酸转染液。继续培养24 h后，肥大组、反义组和错义组加入10-5 mol/L AngⅡ各20 μl。至此，AngⅡ终浓度为2×10-7 mol/L。于37 ℃，5% CO2 培养箱内继续培养。

　　1.4 CT-1反义脱氧寡核苷酸和错义脱氧寡核苷酸序列

　　每条链均经硫代修饰，由北京奥科公司合成。CT-1反义脱氧寡核苷酸序列：5′-TGG CTC ATG CTG GCC CCA GGC TGA T -3′;错义脱氧寡核苷酸序列：5′-ACG CGT CTA GCC TCG ATG TCC GTG G -3′。在寡核苷酸3′端带入异硫氰酸荧光素(FITC)，以便检测脂质体转染效率。

　　1.5 心肌细胞表面积测定

　　相差显微镜在1600倍下应用Motic Images 1.3软件测量心肌细胞的表面积，每孔随机选取5个视野，每个视野测15～25个细胞，取其平均值。

　　1.6 荧光显微镜下观察脂质体转染情况

　　取出各组无菌细胞培养玻片，以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，冷丙酮固定后，于荧光显微镜下观察。

　　1.7 免疫组化法检测CT-1蛋白表达

　　取出各组无菌细胞培养玻片，以冷丙酮固定20 min。置于0.3% H2O2中30 min抑制内源性过氧化物酶。一抗4℃过夜，二抗室温下2 h，DAB显色，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯脱乙醇，封片。采用镜下随机选取10个视野，结果利用北京航空航天大学研制的彩色病理图像分析系统进行分析。

　　1.8 心肌细胞3H-亮氨酸掺入率测定

　　心肌细胞分别加入各种干预因素以及3H-亮氨酸(终浓度为1.85×108 Bq/ml)，24 h后弃掉培养基，PBS液漂洗，胰蛋白酶消化后收集细胞于玻璃纤维素膜上，三氯乙酸固定。滤膜烘干后置于闪烁瓶中，加入闪烁液，用β-液体闪烁仪测定放射强度。

　　1.9 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CT-1和β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA表达

　　用Trizol提取心肌组织中的总RNA，用紫外分光光度计测总RNA纯度和含量，按照TakaRa RT-PCR试剂盒说明书进行操作。选取β-肌纤蛋白(β-actin)为内参，扩增产物的DNA全长764 bp ，上游引物：5′-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3′; 下游引物：5′-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG -3′;β-MHC的扩增产物的DNA全长596 bp ，上游引物：5′-ACC AAG CAG CCA CGC CAG TA-3′;下游引物：5′-TGC TTT GCC TTT GCC CTT GT-3′;CT-1的扩增产物的DNA全长482 bp：上游引物：5- TCT ATG GCT AGT GAG TGA GC -3’;下游引物：5- TGC TTT GCC TTT GCC CTT GT -3’。逆转录条件：42 ℃ 30 min(逆转录)，99 ℃ 5 min(预变性)，5 ℃ 5 min(退火)。PCR反应条件：94 ℃ 5 min(变性)，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s(退火)，共进行30个循环;72 ℃ 5min(延伸)。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，经紫外透射分析拍摄电泳条带。以β-actin为内参照，结果以CT-1/β-actin、β-MHC/β-actin密度比值表示。

　　1.10 统计学处理

　　检测结果以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 10.0软件包进行方差分析，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 心肌细胞表面积检测结果

　　Fugene 6组、错义组与肥大组细胞面积相比差异无显著性(P>0.05)，但较对照组显著肥大(P<0.01)，较反义组也显著肥大(P<0.05)，反义组较对照组显著肥大(P<0.05)，见表1。表1 各组心肌细胞面积测量结果注：与对照组相比△ P<0.05;与肥大组相比▲P<0.05。下表同。

　　2.2 荧光显微镜下观察脂质体转染情况

　　转染24h后，于荧光显微镜下可见荧光标记的CT-1反义寡核苷酸。见图1、2(见封四)。

　　2.3 免疫组化检测结果

　　CT-1阳性细胞内可见大量棕褐色颗粒，主要集中在胞浆，一部分聚集在胞膜，少数分泌出细胞外，分布在细胞周围。肥大组、Fugene 6组、错义组和反义组、对照组相比，均具有显著差异P<0.01。Fugene 6组、错义组与肥大组相比，差异无显著性(P>0.05)。反义组与肥大组相比差异有显著性(P<0.05)。见表2，图3、4(见封四)。

　　2.4 心肌细胞蛋白质合成速率的测定

　　AngII刺激后心肌细胞蛋白合成速率明显增加。统计学分析结果显示：肥大组、Fugene 6组、错义组和反义组心肌细胞蛋白合成速率较对照组明显增加(P<0.05);反义组与肥大组相比差异有显著性(P<0.05)，见表2。表2 各组CT-1免疫组化和3H-亮氨酸掺入量检测结果注：CT-1：心肌营养素。

　　2.5 RT-PCR检测CT-1及β-MHC mRNA表达

　　经AngⅡ刺激后肥大组、Fugene 6组、错义组和反义组CT-1及β-MHC mRNA表达较对照组明显增加(P<0.05)。Fugene 6组、错义组与肥大组相比较，CT-1及β-MHC mRNA表达均无明显变化(P>0.05)。反义组与肥大组相比较，CT-1及β-MHC mRNA表达明显降低(P<0.05)，见表3。表3 各组CT-1及β-MHC mRNA表达的比较注：β-MHC：β-肌球蛋白重链;β-actin：β-肌纤蛋白。

　　3 讨 论

　　在正常情况下，成人心肌细胞不能分裂，蛋白质合成速度也很慢。然而在病理状态下，心脏超负荷，很多新合成的蛋白转为胚胎型异构蛋白以加速蛋白合成的速度，但此种胚胎表型不能像胚胎心脏那样出现分裂，因而出现蛋白合成加速而细胞分裂受阻的反应，导致细胞肥大。此种心肌细胞收缩功能低下，形态改变即长/宽比例增加，可能参与心室扩张的形成[6]。心肌肥大和扩张是心肌细胞肌节增多和重组的结果，心肌细胞延长则与新生肌节相互连接有关[7]。心肌细胞发生肥大时，心肌细胞收缩蛋白则转变为以β-MHC为主。β-MHC呈胚胎表型，一方面它使蛋白质合成加速，而另一方面它又不能象胚胎心肌那样出现分裂、进入细胞周期[8]。这种蛋白质合成加速而细胞分裂受阻的反应实际是非自然的生长反应，是一种适应不良性心肌肥大，对心室重构可能起重要的促进作用[9]。

　　很多实验都证实AngⅡ对心肌细胞是一重要促肥大因子，其可使心肌细胞体积增加，总蛋白质含量增加，而对细胞数量无影响[10，11]。

　　实验中，以3H-亮氨酸掺入率的测量可反映心肌细胞肥大的程度，以β-MHC基因表达量增加为病理性心肌肥大的可靠指标。本实验观察到AngⅡ可明显增加心肌细胞表面积、3H-亮氨酸掺入率和β-MHC 的表达，也再次证实了AngⅡ能够诱导细胞肥大。

　　CT-1是IL-6家族的一种细胞因子，研究显示，与IL-6家族其他成员的心肌肥大诱导作用相比，CT-1作用最强;心力衰竭患者的血浆中CT-1水平明显高于正常人[12]，说明血浆CT-1水平与心室衰竭的严重程度相关;高血压者的血浆CT-1明显增加，CT-1浓度和左室质量指数呈显著正相关[13，14]。以上均提示CT-1是促进心肌肥大的主要细胞因子。因此，本实验利用AngⅡ刺激心肌细胞造成肥大，观察了肥大过程中CT-1的表达情况。同时利用Fugene 6 成功地将CT-1反义脱氧寡核苷酸转染入心肌细胞，抑制CT-1的表达，进而抑制心肌细胞的肥大。说明CT-1参加了心肌细胞的肥大机制，同时也提示了CT-1 反义脱氧寡核苷酸可能是治疗心肌肥大的一条新途径。希望本次实验能够为心肌肥大的发病机制的研究提供一条新的思路，尤其是反义寡核苷酸抑制心肌细胞肥大的作用应该受到重视，以期有助于临床上多种心肌肥大相关疾病的治疗。

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