电压依赖性钾通道1.3在自发性高血压大鼠外周血淋巴细胞表达的变化

　　【摘要】 目的：通过研究自发性高血压大鼠(SHR)外周血淋巴细胞电压依赖性钾通道1.3(Kv1.3)mRNA表达的变化，为SHR淋巴细胞激活提供证据。方法：使用密度离心法采集10只SHR和10只正常Wistar大鼠外周血淋巴细胞,运用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测外周血淋巴细胞Kv1.3 mRNA表达水平。结果：(1)与对照组相比，SHR组Kv1.3 mRNA表达水平明显升高[(0.0023±0.0005)Kv1.3/β-actin mRNA∶(0.013±0.017)Kv1.3/β-actin mRNA，P<0.05];(2) SHR收缩压和淋巴细胞Kv1.3mRNA表达呈正相关(r=0.830，P=0.003)。结论：SHR淋巴细胞Kv1.3 mRNA表达增高，提示钾通道可能在高血压病淋巴细胞激活中起着重要的调控作用，推测淋巴细胞钾通道增多可能与高血压的发生、发展密切相关。

　　【关键词】 大鼠，近交SHR; 淋巴细胞; 钾通道

　　Lymphocyte Kv1.3 mRNA level up regulate in spontaneously hypertensive rat/LUO Jian, ZHANG Yuanming, WANG Lingpeng,LIANG Ping, ZHANG Yalou//Department of Cardiology of the First Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University, Urumqi,Xinjiang，830054, China

　　Corresponding author:ZHANG Yuanming，Email:aymdxx@163.com

　　Abstract：Objective:To determine express of Kv1.3 mRNA in lymphocyte derived from spontaneously hypertensive rat (SHR), which aimed to identify the relationship between lymphocyte Kv1.3 and hypertension.Methods:Peripheral blood were collected from SHRs(10 cases) and normotensive Wistar rats(10 cases).Peripheral lymphocytes were separated from heparinized whole blood by standard Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation.Real-time PCR was used to detect the express of Kv1.3 mRNA in lymphocyte.Results:(1)The expression levels of Kv 1.3 mRNA in lymphocytes from SHRs significantly increased compared with that of Wistar rats[(0.0023±0.0005)Kv1.3/β-actin mRNA∶(0.013±0.017)Kv1.3/β-actin mRNA，P<0.05];(2) Linear correlation existed between systolic blood pressure and expression of Kv1.3 mRNA in lymphocytes from SHR (r=0.830，P=0.003).Conclusion:The lymphocytes Kv1.3 mRNA expression level up regulate in SHR,it suggests Kv1.3 contribute to the development of hypertension.

　　Key words：Rats,inbred SHR; Lymphocyte;Potassium channels

　　淋巴细胞钾通道是淋巴细胞激活的关键。电压依赖性钾通道(voltage dependent K channel,Kv channel)是淋巴细胞上主要的钾通道之一;当淋巴细胞受刺激而活化时，Kv通道通过控制离子跨膜流动对细胞内离子浓度和膜电位水平发挥调节作用，参与淋巴细胞的分化、增殖和激活等重要生理过程;因此，目前认为 Kv通道是参与淋巴细胞功能调控的重要因素之一[1-3]。研究表明[4-6]淋巴细胞上的钾通道参与了慢性牙周炎、冠心病、多发性硬化等一些炎性疾病的发生，淋巴细胞钾通道是否参与了高血压病的发生发展仍不清楚。本研究运用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测自发性高血压大鼠(SHR)和正常血压大鼠外周血淋巴细胞Kv1.3 mRNA 表达的变化，探讨淋巴细胞钾通道在高血压病中的变化，为高血压病淋巴细胞激活提供实验支持。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　1.1.1 标本的选择：选择雄性SHR及正常Wistar大鼠，分别购自北京维通利华实验动物有限责任公司和新疆医科大学动物实验中心。体重200～250g，平均(223±18)g。SHR组10只，对照组10只。所有操作程序经过新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准。

　　1.2.2 主要试剂及设备： 大鼠淋巴细胞分离液购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，异硫氰基荧光素标记的抗CD3单抗购于美国Sigma公司，TRizol试剂盒购自Invitrogen公司，反转录试剂盒为美国Promega 公司产品，实时荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司， BIO-RAD IQ5荧光定量PCR扩增仪、Quality 图像分析系统产自美国伯乐公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠无创血压测定：大鼠于40℃预热15min，用BP-6无创血压监测仪测量大鼠清醒安静状态下尾动脉的血压。

　　1.2.2 大鼠淋巴细胞分离：用密度梯度离心法分离出单个核细胞，获得的细胞用异硫氰基荧光素标记的抗CD3单抗标记后，经流式细胞术分选测定，其中>80%或90%为淋巴细胞。

　　1.2.3 SYBR实时定量PCR测定淋巴细胞Kv1.3、KCa3.1 mRNA的表达

　　(1)引物设计：在基因库选取大鼠Kv1.3 (序列号NM-019270)和β-肌纤蛋白(β-actin)mRNA序列(序列号NM-031144)，引物设计用Primer引物5.0设计完成，由大连宝生物工程有限公司合成，β-actin为内对照。 Kv1.3引物序列：上游引物5′GGAAGCTCCGGGAACAAGTG 3′，下游引物5′TGCCAGCCCATGGATTCTC3′,产物为121bp。β-actin引物序列：上游引物5′GGAGATTACTGCCC TGGCTCCTA 3′，下游引物5′GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG 3′，目的片段为150bp。

　　(2)RNA提取和cDNA合成：用Trizol试剂常规提取大鼠淋巴细胞总RNA，溶于20μl二乙基焦磷酰胺(DEPC)处理水中，用紫外分光光度计检测光密度(OD)值，波长260/280比值在1.8～2.0之间。按照反转录试剂盒说明书将淋巴细胞总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：42℃ 30 min，95℃ 5 min，4℃ 5 min，获得的cDNA-20℃ 保存备用。

　　(3)标准曲线建立和定量PCR反应：将合成的cDNA进行PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，然后使用PCR产物构建标准曲线。按照说明书，使用SYBR实时荧光定量PCR试剂盒在BIO-RAD IQ5实时荧光定量PCR系统上扩增产物。Kv1.3 PCR反应程序：95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 62℃ 30 s， 40个循环。总反应体系为25μl，包括SYBR Premix Ex TaqTM12.5μl、0.4 mmol/L上、下游引物0.5μl，cDNA模板2μl，灭菌蒸馏水9.5μl。标准曲线和熔解曲线由PCR仪器自动生成。获得待测样本和对照样本中目的基因及内参基因的相对表达量，计算各组均数及标准差后，将目的基因与内参基因进行比较，得到目的基因相对表达量的变化。

　　1.3 统计学处理

　　统计数据由SPSS11.0软件完成，数据用均数±标准差(±s)表示,各组均数之间比较采用t检验，P <0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 两组大鼠淋巴细胞Kv1.3表达水平

　　2.1.1 实时荧光定量PCR扩增曲线及基因扩增效率：Kv1.3基因的扩增曲线平滑，有明显的指数扩增期;与Kv1.3基因标准曲线相关系数为0.994，说明定量结果准确可靠;根据斜率计算出基因扩增效率是102.6%(图1)。

　　图1 实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测结果

　　注：a为Kv1.3的荧光信号强度随扩增循环数的增加而呈指数增长趋势的扩增曲线图，b为Kv1.3不同稀释度的扩增标准曲线。

　　2.1.2 PCR产物分析：熔解曲线分析显示两组Kv1.3 PCR产物的熔解曲线为单一锐利主峰，说明无引物二聚体及非特异性扩增;并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果条带位置准确(图2)。

　　2.1.3 两组大鼠淋巴细胞Kv1.3mRNA相对表达量的比较：SHR淋巴细胞Kv1.3 mRNA表达量为(0.013±0.017)Kv1.3/β-actin mRNA，较对照组的(0.0023±0.005)Kv1.3/β-actin mRNA明显增加(P<0.05)，见图3。

　　2.2 SHR尾动脉收缩压和淋巴细胞Kv1.3 mRNA表达的相关性分析

　　SHR收缩压和淋巴细胞Kv1.3 mRNA表达呈正相关(r=0.830，P=0.003);而正常大鼠与淋巴细胞Kv1.3 mRNA表达之间无明显的相关性，提示淋巴细胞Kv1.3 表达增多可能与高血压病密切相关。

　　3 讨 论

　　Savoia C[7]指出炎性细胞激活参与了高血压的发生发展，并且为高血压的治疗提出了新的研究方向。在动物实验中发现,SHR存在着炎性细胞的激活,且成年大鼠的炎症细胞激活较幼年大鼠更加明显;在高血压病患者体内也发现其外周血存在单核细胞的激活[8，9]。高血压是以炎性细胞系统激活为特征的慢性炎症过程。Somers[10]研究表明在淋巴细胞缺陷大鼠模型体内使用血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)干预不会引起血压升高。另外有研究报道Ang II激活淋巴细胞后释放的肿瘤坏死因子(TNF)-α，参与血压升高，使用药物阻断TNF-α可防止血压升高，提示淋巴细胞激活能够通过释放细胞因子参与高血压病的发生发展[11]。

　　膜片钳研究证明钾通道在淋巴细胞激活过程中发挥着重要的作用，研究证实Kv1.3通道是淋巴细胞上主要表达的钾通道类型。静息时每个淋巴细胞上表达250～400个Kv1.3通道，激活后Kv1.3通道达到1500～2000个/细胞;淋巴细胞上的Kv1.3通道通过钙离子通道共同调节钙内流，调节膜电位，促进钙内流，细胞内Ca2+ 浓度的升高,可以通过钙调素依赖磷酸酶等中间环节,作用于细胞核的DNA，调节细胞因子等的基因表达,激活淋巴细胞[12-13]。细胞对于不同刺激产生增殖、活化、分化,其细胞膜上电压依赖性钾通道随之发生变化,而改变这种外向型钾电流通常是在转录和翻译的水平上完成的[14]。

　　目前尚未见关于高血压病淋巴细胞钾通道的研究报道。本实验采用实时荧光定量PCR技术检测SHR和正常血压大鼠淋巴细胞Kv1.3 mRNA的表达，结果显示SHR淋巴细胞Kv1.3 mRNA的表达水平高于正常血压大鼠，提示 SHR 淋巴细胞上存在更多有功能的钾通道。Lewis[13]研究证实淋巴细胞钾通道表达增多，有利于保持淋巴细胞活化时细胞外钙离子的持续内流，引起血压升高。另外本实验将SHR尾动脉收缩压和淋巴细胞Kv1.3 mRNA表达之间进行相关性分析，结果显示二者之间存在正相关，提示淋巴细胞Kv1.3 表达增多与高血压病密切相关。

　　【参考文献】

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　　[4]Wulff H, Calabresi PA, Allie R, et al. The voltage-gated Kv 1.3 K+ channel in effector memory T cells as new target for MS[J].J Clin Invest, 2003, 111 (11)： 1703-1713.

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　　[10]Somers MJ, Mavromatis K, Galis ZS, et al. Vascular superoxide production and vasomoto