核转录因子kappaB在急性心肌梗死的作用研究

　　【摘要】 目的 探讨急性心肌梗死后(AMI)患者外周血单个核细胞(PBMCs)核因子-kappaB (NF-κB) 活化与血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、 白介素-1β(IL-1β)分泌的相关性。方法 选取30例首次急性心肌梗死患者为观察组(AMI 组)，25例体检正常人为健康对照组，两组PBMCs 的NF-κB表达应用细胞免疫化学染色检测，血浆细胞因子TNF-α、IL-1β由放射免疫法测定。对两组指标进行t检验及相关性分析。结果 ①AMI 组血浆外周血PBMCs的NF-κB 核染色阳性百分率、TNF-α、IL-1β分泌表达均显著增加高于健康对照组( P<0.01)。②AMI患者外周血PBMCs的NF-κB核染色阳性百分率与TNF-α、IL-1β表达均显著正相关(P<0.05)。结论 AMI患者外周血PBMCs的NF-κB活性增高，可以通过促进细胞因子(TNF-α、IL -1β)的分泌来参与AMI的心源性休克、心力衰竭和心室重塑等病理生理过程。

　　【关键词】 核因子kappa-B;肿瘤坏死因子-α;白介素-1β;急性心肌梗死

　　Study on the effects of nuclear factor kappa-B in the acute myocardial infarction

　　FAN Dong-mei, XUE Li.(Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To investigate the role of NF-κB activation in the development of acute myocardial infarction, and to investigate the relationship of NF-κB activation on peripheral blood mononuclear cell (PBMCs) and the level of TNF-αand IL -1β.Methods Thirty acute myocardial infarction patients defined as observing group (AMI group); twenty people defined as normal control group. And the activity of NF-κB was measured by immunocytochemical staining. Plasma cell cytokine (TNF-αand IL-1β) were measured with radio immunity assay. Two sets index was matched with T-test and correlation analysis. Results Comparing with the normal control group, NF-KB activation, TNF-αand IL -1βwas bonded to be increased in acute myocardial infarction (P<0.01). NF-KB activation were positively correlated with the level TNF-αand IL -1β(P<0.05).Conclution Increased NF-KB activation may be up regulate cytokine in acute myocardial infarction. NF-KB is one of factors for pathophysiology of cardiac shock, heart failure and ventricles remodeling in acute myocardial infarction.[Key words] NF-kB ; TNF-a; IL -1β; acute myocardial infarction

　　随着人民生活水平的提高、生活节奏的加快，急性心肌梗死(acute myocardial infarction , AMI)的发病率逐年上升，是死亡率较高的心血管疾病。NF-κB(nuclear factor-kappaB)是一种具有基因转录多项功能的核转录因子，是1986年Sen和Baltimore 应用凝胶电泳迁移率试验分析B细胞核提取物中发现的，其被激活后可与具有κB序列的基因结合，调控相应基因的表达;NF-κB参与炎症、免疫调节及调控细胞的凋亡、增殖、分化等过程。 NF-κB作为一种炎症反应调节因子,一直被认为是一种主要的冠状动脉粥样硬化发生发展的因子[1]。 本研究应用细胞免疫化学染色观察AMI患者外周血单个核细胞(PBMCs)的NF-κB表达及其与血浆细胞因子TNF-α、IL-1β分泌的相关性。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料：

　　1.1.1 研究对象：急性心肌梗死患者来自2008年12月至2009年6月我院心内科住院，共30例，男16例，女14例，平均年龄(60.5±8.5)岁。正常对照组25 例,为健康体检者, 男15例, 女10例, 平均年龄(58.1 ±8.6) 岁。AMI的诊断标准根据1981年WHO制定心肌梗死诊断标准。心功能采取killip分级法，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。所有受试者均除外感染、哮喘、风湿活动及内分泌疾病等。

　　1.1.2 试剂及仪器 ：淋巴细胞分离液(中国医学科学院生物工程研究所)、1640培养基(Sigma Co)、小牛血清(FCS，郑州佰安生物工程有限公司)、细胞离心机cytospin-2型 (British.SHANDON) 、NF-κB(p50)兔抗、链酶亲和素一生物素过氧化物酶试剂盒(SABC)、试剂盒(单克隆鼠抗兔)及DAB试剂盒均购自武汉博士德公司。TNF-α、IL-1β放免试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放射免疫研究所。

　　1.1.3 标本采集：采血均得到患者同意，用肝素锂5ml真空采血管无菌采取确诊AMI患者发病的3d内空腹静脉血5ml。

　　1.2 方法：

　　1.2.1 PBMCs的分离：取抗凝3ml血液用磷酸缓冲液(PBS)1∶1稀释后， 以2∶1体积置于淋巴细胞分离液上, 3000r/min 离心30min, 收集试管中间悬浮的一层乳白色的液体,即为PBMCs。再以PBS洗涤3次, 每次1000r/min 离心5min。用台盼蓝拒染试验活细胞比例大于95%为有效标本。1640培养基调整细胞数为25×107个/ml，取100μl细胞混悬液滴入细胞离心机600r/min，离心6min，使细胞甩于载玻片上，室温下自然风干, 丙酮固定5min, 干燥后保存于-70℃冰箱待测NF-κB活性。

　　1.2.2 NF-κB的免疫组化染色(SABC法)：第一抗体选用兔抗NF-κBp50亚单位的多克隆抗体，抗体稀释度经预实验定为1×100，二抗为生物素化单克隆小鼠抗兔IgG，采用SABC法试剂盒检测。操作步骤按试剂盒说明书进行，每张涂片随机选取5个不重叠的高倍镜视野,随机计数500个细胞，计算细胞核阳性的细胞数占细胞总数的百分率。免疫细胞化学染色结果判定：PBS代替一抗为空白对照，细胞染色棕黄色者为阳性，定位于胞质与胞核。PBMCs中NF-κB的活化水平用NF-κB(+)cells占所有定量化的PBMCs的百分比来表达。即阳性率=阳性细胞数/总细胞数×100%

　　1.2.3 血浆细胞因子的测定：取出 2ml 血液置于离心管中，以2500r/min离心20min, 取上层血浆置于-70℃冰箱保存，待测细胞因子(TNF-α、IL-1β);利用液相竞争抑制原理，采用平衡法对样品进行测定。将待测样品或标准与限量的抗血清及标记的抗原加在一起进行竞争结合反应，加入免疫分离剂分离出抗原抗体复合物，测定复合物的放射性(B)，计算各标准管的结合率(B/B0%)做出标准曲线，由GC-1200 r 放射免疫计数器查出样品浓度。

　　1.2. 4 应用SPSS 11.5分析软件，计量资料均采用(±s)表示，组间比较采用t检验。PBMC的NF-κB与细胞因子间的相关程度采用直线相关性分析法，以P< 0.05 表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 AMI 组血浆TNF-α、IL-1β和外周血单个核NF-κB核染色阳性百分率测量结果均显著高于健康对照组(见图1-图4、封3，表1)。急性心肌梗死患者外周血单个核NF-κB核染色阳性百分率为(26.67±7.84)%，显著高于健康对照组(9.72±4.82)%(P<0.01)。

　　2.2 通过相关性分析发现：急性心肌梗死患者外周血单个核细胞NF-κB核染色阳性百分率与TNF-α、IL-1β表达均呈正相关(r TNF-α=0.618, P<0.01;rIL-1β=0.419, P<0.05)。

　　2.3 通过χ2检验发现：对照组和观察组的性别和心功能分级(killip分级)差异无统计学意义。表1 AMI患者及健康对照者外周血单个核细胞NF-kB染色阳性率与血浆细胞因子测定

　　3 讨论

　　试验发现，当小鼠心肌细胞IL-1β基因表达增加，可导致心肌细胞Na+-K+-ATP酶蛋白的表达下降，抑制了它的活性，导致心肌收缩力下降，心功能不全[2]。另有试验证实，TNF-a和IL-1β可诱导原癌基因c-jun的持续激活，通过与活化蛋白-l(AP-l)位点的结合导致MMPS基因的激活，进而使MMPs转录增加[3]。

　　近年研究认为，NF-kB可接受上述细胞因子的刺激，NF-κB被激活后可增强TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的转录[4-6]，TNF-α、IL-1β等炎症因子水平的升高又可进一步增强NF-κB的激活，从而形成“正反馈”。Frantz等[7]用ELISA等方法对心肌梗死后10周鼠的心肌细胞NF-κB易位情况的研究表明：在心肌梗死后心肌细胞中NF-κB慢性并持续的激活。动物实验表明NF-κB的活化可以促发并加剧心肌肥厚、心功能恶化[8]。

　　本实验研究表明：NF-κB在AMI患者的外周单个核细胞的表达明显高于正常人，核染色深于胞质染色。这表明，在一定因素的刺激下NF-κB与IκB解离，发生了核移位;而健康对照组的外周单个核细胞的NF-κB染色多位于胞质中，核染色较少。也就是说其生物活性低。另外，AMI组血浆细胞因子TNF-α、IL-1β的水平也显著升高。本试验还发现，NF-κB染色的阳性百分率与细胞因子TNF-α、IL-1β的水平显著正相关，说明NF-κB在AMI中通过促进细胞因子TNF-α、IL-1β分泌来参与心源性休克、心律失常、心室重塑和心力衰竭等病理生理过程。本实验采用细胞免疫细胞化学法，比较直观，可以清楚观察NF-κB p50,在胞质和细胞核内分布的情况，操作简便，可同时对NF-κB进行定位和半定量检测。但若对NF-κB精确地检测应采用Western blont或EMSA法。

　　【参考文献】

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　　[3] Kreydiyyeh SI，Abou-Chahinec，Hlaldandanr.Interieukin -lbetainhibits Na+-K+ ATPase activity and protein expression in cardiac myocytes [J].Cytokine，2004，26(l):l-8.

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　　[7] Frantz S，Fraecarllo D，Wagner H，et al.Sustained activation of nuclear factor kappa B and activator protein 1 in chronic heart failure[J].Cardiovasc Res,2003,57:749-756.

　　[8] Gupta S, Young D, Sen S.Inhaition of NF-KappaB Induces regression of cardiac hypertrophy, independent of blood pressure control，in spontaneously hypertensive rats [J].Physiol Heart Circ Physiol,2005,289(l):H17-9.