青阳参总甙治疗小鼠肝损伤机制的初步研究

　　【摘要】 目的 探讨青阳参总甙治疗肝损伤的免疫机制。 方法 40只健康小鼠被随机分为四组：对照组每天腹腔注射等量生理盐水;模型组在实验的第1d和第5d腹腔注射CCl4，同时每天灌胃等量的生理盐水;治疗组在实验的第1d和第5d腹腔注射CCl4，同时每天腹腔注射青阳参总甙溶液，大剂量组100mg/(kg·BW)，小剂量组50mg/(kg·BW)。以上各组均连续实验7d，在实验第8d摘眼球取血。用流式细胞仪对小鼠外周血T细胞亚群进行检测，用酶联免疫法检测血浆中IL-4和IFN-γ的含量，称脏器重量，计算脏器指数，并进行肝脏常规病理检查。结果 青阳参可显著降低肝损伤小鼠的肝脏指数，减轻肝组织病理损伤程度，提高外周血CD+4T细胞的百分比和CD+4T细胞 / CD8+T细胞的比值，降低CD8+T细胞的百分比，对血浆中IL-4和IFN-γ的含量无明显影响。结论 青阳参总甙调整CD+4T细胞和CD8+T细胞之间的平衡，这可能是其治疗肝损伤的机理之一。

　　【关键词】 青阳参总甙;CCl4;肝损伤;T细胞亚群;IL-4; IFN-γ

　　Mechanism of Qingyangshenylycosides(QYS) treating on liver injury in mice

　　SUN Shu-kai, et al.(Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To research the immune mechanism of Qingyangshen ylycosides (QYS) treating on liver injury.Methods 40 healthy adult mice were chosen and randomly divided into four groups: Control group was given same volume normal saline by imp. every day; Model group was given CCl4 by i.p. on the first and the 5th day, and it was given same volume normal saline by i.p. every day; Treatment groups were given CCl4 by i.p. on the first and the 5th day, and they were given QYS by i.p. every day. Those measurements were taken for seven days. On the 8th day, after blood samples of every group were collected, the T-lymphocytes Subgroup was detected by FCM and the levels of IL-4 and IFN-γ in plasma were detected by ELISA .Weigh in viscera and calculate index of viscera. The pathological change of liver tissue was inspected.Results QYS could significantly decrease liver index, relieve pathological damage in liver. Compared with model group, the percentage of CD4+ T-lymphocytes and CD4+ T-lymphocytes / CD8+ T-lymphocytes ratio of mice in peripheral blood in QYS treatment groups increased, and the percentage of CD8+ T-lymphocytes decreased. There was not evident influence on the levels of IL-4 and IFN-γ in plasma.Conclusion QYS can regulate the balance of between CD4+ T-lymphocytes and CD8+ T-lymphocytes. It maybe one of mechanism for QYS treating on liver injury.

　　[Key words] Qingyangshenylycosides; CCl4; Liver injury; T-lymphocytes; IL-4

　　青阳参为萝摩科鹅绒藤属植物青阳参(Qingyangshenylycosides.)的干燥根，又名青羊参、白石参、青洋参等，分布在我国的贵州、云南等西南部地区，性甘、辛、温，具有祛风镇痉、解毒止痛、补益肝肾的作用[1]，主要有效成分是青阳参总甙[2]。本研究用青阳参总甙对肝损伤小鼠进行治疗，观察青阳参总甙对肝损伤小鼠的肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数、病理形态学变化、T细胞表面分子CD3、CD4、CD8以及血浆中IL-4和IFN-γ等指标的影响，探讨青阳参治疗肝损伤的免疫机制，为青阳参作为调节免疫用药提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物：清洁级昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重(20±2)g，购自宁夏医科大学实验动物中心[许可证号SCXK(宁)2005-001]。

　　1.2 药物和试剂:青阳参总甙由中国科学院昆明植物研究所提供，用时溶于1.5%的吐温-80溶液中;CCl4(分析纯); 荧光标记的大鼠抗小鼠单克隆抗体CD3e-FITC、 CD4-PE 、CD8a-PE及相应荧光标记阴性抗体FITC-IgG2b、PE-IgG均购自美国Miltenyi Biotec公司;大鼠抗小鼠IL-4、IFN-γ检测试剂盒购自美国ADL公司。

　　1.3 主要仪器和设备:美国BD公司FACSCalibur流式细胞分析仪;BIO-RAD680酶标仪;BIO-RAD1575洗板机;BECKMEN低温离心机;涡旋振荡器等。

　　1.4 分组与给药:40只小鼠随机分为四组：对照组、模型组、青阳参总甙大剂量组和青阳参总甙小剂量组各10只，实验室观察2d后进行实验。对照组每天腹腔注射等量生理盐水，模型组和治疗组动物均在第1d和第5d腹腔注射1%CCl4花生油溶液0.03ml/(10g·BW)，治疗组每天腹腔注射青阳参总甙溶液，大剂量组100mg/(kg·BW)，小剂量组50mg/(kg·BW)，连续7d。以上各组动物均于第8d称小鼠体重，摘眼球取血，迅速放入含有肝素钠(1∶500)的EP管内，混匀，处死小鼠，取小鼠的肝脏、脾和胸腺，称重，然后立即取肝左叶组织放入10%的中性缓冲福尔马林液固定。

　　1.5 指标检测

　　1.5.1 一般情况观察:各组小鼠的食欲、大便、毛色、活动等一般状况。

　　1.5.2 小鼠肝脏指数、胸腺指数和脾指数的测定:实验时称小鼠体重，然后将小鼠处死，取出小鼠肝脏、胸腺和脾脏，立即用电子天平称重，记录数据，并按以下公式计算：脏器指数=脏器重量(mg) /小鼠体重(g)。

　　1.5.3 病理学检查:取小鼠肝组织经10%中性福尔马林液固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚5μm，进行HE染色，然后显微镜下进行形态学观察。

　　1.5.4 T细胞亚群的测定:严格按照试剂盒说明书操作，然后用FACSCalibur流式细胞分析仪检测T细胞表面分子CD3、CD4、CD8等指标，计算CD+4T细胞 / CD8+T细胞比值。

　　1.5.5 血浆中IL-4和IFN-γ的检测:取小鼠血，分离血浆，用酶联免疫法严格按照试剂盒的操作步骤进行检测。

　　1.6 统计学分析:数据以均值±标准差(±s)表示，用SPSS13.0统计学软件对数据进行处理。首先用F检验验证方差齐性，然后用one way-ANOVA对试验结果数据进行单因素方差分析，随后的两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 一般状况:给药后每日观察各组小鼠的行为、自主活动、摄食、饮水、毛发、粪便、尿液均未见异常，眼、耳、鼻、口亦未见分泌物。

　　2.2 青阳参总甙对肝损伤小鼠肝指数、脾指数、胸腺指数的影响:各组小鼠肝指数、脾指数、胸腺指数的测定结果。与对照组相比，模型组的肝脏指数有极显著的增加(t=3.90，P<0.01)，青阳参总甙大、小剂量组使升高的肝脏指数显著地降低(t=-2.87， P<0. 05;t=-3.032，P<0. 05)。各组间脾指数和胸腺指数的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。表1 青阳参总甙对小鼠肝指数、脾指数、胸腺指数的影响 注：与模型组比较*P<0.05;与对照组比较△P<0.01

　　2.3 青阳参总甙对肝损伤小鼠肝脏病理学结果的影响:对照组：小鼠肝小叶结构正常、清晰，细胞核位于细胞中央，圆而边界清(图1，见封3);模型组：小鼠肝细胞明显水肿、气球样变，肝索排列紊乱，可见核固缩，肝细胞点状坏死，中央静脉和汇管区周围出现弥漫性的炎细胞浸润(图2，见封3);青阳参小剂量组和大剂量组大部分肝细胞结构完整，肝细胞水肿、气球样变及炎细胞浸润均明显减轻，见图3、4(见封3)。

　　2.4 青阳参总甙对肝损伤小鼠外周血T细胞亚群的影响:各组小鼠外周血CD+3细胞、CD+4T细胞、CD8+T细胞、CD+4T细胞 / CD8+T细胞的检测结果。各组之间CD+3细胞的差异无统计学意义(F=0.99，P>0.05)。与对照组相比，模型组小鼠外周血CD4+T细胞的百分比显著降低，CD8+T细胞的百分比显著升高;青阳参总甙小剂量组和大剂量组小鼠外周血CD+4T细胞的百分比与模型组相比显著升高，CD8+T细胞的百分比显著降低;治疗组各指标与对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05),见表2。表2 青阳参总甙对小鼠外周血T细胞亚群的影响 与模型组比较*P<0.05;与对照组比较△P<0.05。

　　2.5 青阳参总甙对肝损伤小鼠血浆中IFN-γ和IL-4水平的影响:各组间小鼠血浆中IFN-γ 和IL-4浓度的差别无统计学意义(P>0.05)，见表3。表3 青阳参总甙对肝损伤小鼠血浆中IFN-γ和IL-4的影响

　　3 讨论

　　T淋巴细胞是构成机体免疫系统的重要细胞群体，根据T细胞表面分化抗原和功能的不同，可将T细胞分为4个主要的亚群：即辅助性T细胞(Th)、抑制性T细胞(Ts)、细胞毒性T细胞(CTL)和迟发性超敏反应性T细胞(TDTH)。这些淋巴细胞亚群在免疫应答过程中相互协作、相互制约，共同完成对抗原物质的识别、应答和消除，从而维持机体内环境稳定[3]。其中Th(CD4+)、Ts(CD8+)和CTL(CD8+)在免疫应答中起着十分重要的作用。CD4+细胞减少提示机体抗感染免疫反应受到损害，CD8+细胞增多有利于清除病毒，但也可能参与肝细胞的损伤，有研究发现T淋巴细胞活化能力不足，可导致免疫调节失调和持续性病毒感染，进而可导致肝炎的慢性化[4]。

　　在免疫应答的过程中，Th细胞起着重要的调节作用，Th细胞又分为Th1细胞和Th2细胞两个亚群，Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ等，介导细胞免疫应答，Th2细胞主要分泌IL-4、5、10等，介导体液免疫应答 [5]。Th1和Th2细胞是互相调节、互相制约的，它们的失调与感染性疾病以及自身免疫性疾病有关[6,7]。通过检测血液中IFN-γ和IL-4的水平可以近似地反映机体内Th1和Th2细胞的平衡状况。

　　本研究发现， CCl4导致小鼠肝脏明显损伤，肝脏指数明显增加，外周血中 CD4+T细胞的百分率降低，而CD8+T细胞的百分率升高，CD4+ T细胞和CD8+T细胞比值倒置，说明CCl4损伤肝脏后引起小鼠体内T细胞亚群的比例失调，导致机体免疫平衡功能失调。而用青阳参总甙治疗后，可以明显降低肝脏指数，减轻肝损伤的程度，CD4+T细胞的百分率，CD4+ T细胞/ CD8+T细胞的比值显著升高，而CD8+T细胞的百分率降低，说明青阳参总甙可以调整CD4+细胞和CD8+T细胞之间的平衡状况，纠正机体免疫功能的紊乱。

　　本研究还检测了各组小鼠血浆中IFN-γ和IL-4的水平，以观察肝损伤小鼠体内Th1和Th2细胞亚群的平衡状况。实验结果可以看出CCl4肝损伤并未导致机体Th1和Th2细胞亚群的平衡失调，这可能是由于CCl4导致的肝损伤为急性化学性肝损伤，对Th细胞亚群的影响不大。

　　总之，青阳参总甙可通过提高CCl4肝损伤小鼠外周血中CD4+T细胞的百分率，降低外周血中CD8+T细胞的百分率，调节T细胞亚群的平衡状况，调节机体的免疫功能，达到治疗肝损伤的目的，这可能是青阳参总甙治疗肝损伤的免疫机制之一。

　　【参考文献】

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