宁夏回汉族白癜风患者HLA相关基因频率分布差异性研究

　　【摘要】 目的 探讨宁夏回、汉族白癜风患者HLA-DRB1*03、*07、*12、HLA-DQB1*02等位基因的差异性。 方法 采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法对114例白癜风患者(汉族84例，回族30例)及对照组进行HLA上述四个等位基因检测。 结果 宁夏回、汉族正常对照组四个等位基因频率的比较示：回族HLA-DRB1*12 (15.00%比6.11%)等位基因频率较汉族增高(P<0.05)，并且宁夏汉族患者组HLA-DRB1*12 (15.47%比6.11%)等位基因频率较正常组增高(P<0.05)。结论 宁夏汉族人群，HLA- DRB1*12等位基因可能与白癜风的发病有关。

　　【关键词】 白癜风;等位基因;HLA

　　Study of the difference in frequencies distribution of HLA vitiligo-related genes between Hui and Han

　　ethnic vitiligo patients in Ningxia

　　LIN Bing-bing, DUAN Ai-xia, WANG Jing-xia, et al.(The Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To investigate the difference between Hui and Han vitiligo patients in HLA-DRB1*03, *07, *12,HLA-DQB1*02 allele genes in Ningxia.Methods The HLA-DRB1*03, *07, *12, HLA-DQB1*02 alleles were detected by poly-merase chain reaction--sequence specific primers (PCR-SSP)method in 114 patients with vitiligo and normal controls in Ningxia.Results In control group the frequencies of HLA-DRB1*12 in Hui (15.00%) were higher than that in Han (6.11%). And in Ningxia Han group the frequencies of HLA-DRB1*12 in patients (15.47%) is higher than that in control group (6.11%).Conclusion HLA-DRB1*12 allele may be associated with the incidence of vitiligo in Ningxia Han nationality.

　　[Key words] Vitiligo; Alleles; HLA

　　白癜风是一种常见的获得性色素障碍性皮肤病，一般人群患病率约0.5%-1%，目前治疗的手段很多，但还没有一种绝对有效的方法，因为其病因尚未完全明了, 白癜风患者中具有阳性家族史者国外为18.75%-40%[1]，国内为3%-12%，多数学者认为遗传因素参与了白癜风的发病，为了探讨宁夏地区回、汉族白癜风患者与HLA(组织相容抗原)等位基因的相关性，本研究采用PCR-SSP方法，对114例白癜风患者及正常对照组进行HLA-DRBl*03、HLA-DRB1*07、HLA-DRBl*12 、HLA-DQB1*02位点基因频率比较，现报告如下。

　　1 对象和方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1 实验组：搜集2007-2008年宁夏医科大学附属医院皮肤科门诊确诊的114例回汉族白癜风患者，其中汉族白癜风患者84例，男47例，女37例，平均年龄26.5岁;回族患者30例，男12例，女18例，平均年龄26.5岁;家族史的确认除先证者本人外，其I、Ⅱ、Ⅲ级亲属中至少还有1例白癜风患者。对再次随诊中有更改者以最后1次记录为准。

　　1.1.2 对照组：选取银川市健康献血者130 例，汉族90例，回族40例，性别、年龄与患者组差异无统计学意义，由银川市博尚体检中心提供。其中回族研究对象均为三代以内的纯回民。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 引物设计与合成：序列特异性引物(SSP)共4对,如下：DRB1*03-5'TAC TTC CAT AAC CAG GAG GAG A，3'TGC AGT AGT TGT CCA CCC G，扩增片段151bp;DRB1*07-5'CCT GTG GCA GGG TAA GTA TA，3'CCC GTA GTT GTG TCT GCA CAC，扩增片段232bp;DRB1*12-5'AGT ACT CTA CGG GTG AGT GTT，3'CAC TGT GAA GCT CTC CAC AG，扩增片段248bp;DQB1*02-5'GTG CGT CTT GTC AGC AGA AG，3'GCA AGG TCG TGC GGA GCT，扩增片段205bp;内对照引物扩增DRB1等位基因第三内含子,序列为: 5'TGCCAAGTGGAGCACCCAAA, 3'GCATCTTGCTCTGTGCAGAT,扩增片段为796 bp。上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2.2 DNA提取：抽取外周静脉血5ml(EDTA抗凝)，采用血液/细胞/组织基因组DNA试剂盒(由天根公司提供)，通过红细胞裂解、蛋白酶解、乙醇沉淀、吸附柱漂洗、晾干、洗脱等步骤提取基因组DNA。

　　1.2.3 PCR扩增：采用Golden Easy PCR System(天根)，在反应体系中加入2×Reaction Mix 7.5μl，样品DNA模板1.5μl，两端引物(1pmol/μ1)各1μl，内对照引物(0.5pmol/μ1)0.2μl， Taq聚合酶(2.5u/μ1)0.12μl混合。在PCR扩增仪中按下列参数进行扩增，94℃预变性4min，94℃变性30s，64℃退火1min，72℃延伸30s，扩增30个热循环，72℃后延伸4min，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯透射凝胶成像仪系统中观察HLA-DRB1*03、*07、*12、HLA-DQB1*02等位基因在回汉族白癜风患者和对照组的分布结果。

　　1.3 统计学分析:用直接计数法分别统计出病例组与对照组中所测等位基因阳性的例数，基因频率计算采用其估计式：阳性频率/2，运用SPSS 11.5统计软件采用卡方检验、Fisher's精确概率法计算χ2值、P值。

　　2 结果

　　2.1 PCR扩增结果：经PCR扩增后，所有研究对象的标本均呈现一条片段，此片段与预增片段796bp相符，此为内参照。而另一条片段则因个体差异不同而部分呈现，且与预增的目的片段相符，此为阳性条带,见图1(目录后)。阳性条带片段为205bp，内参照片段为796bp。

　　2.2 宁夏回、汉族正常对照组四个等位基因频率的比较：结果如表1所示。回族HLA-DRB1*12 的等位基因频率是15.00%，汉族的等位基因频率是6.11%，回族显著高于汉族(P<0.05)，而其余等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。宁夏回、汉族患者组四个等位基因频率差异无统计学意义，见表2。

　　2.3 宁夏汉族患者组HLA-DRB1*12 (15.47%比6.11%)等位基因频率：较正常组增高(P<0.05，见表3)。而宁夏回族白癜风患者组与正常对照组四个等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05，见表4)。表1 宁夏回、汉族正常对照组四个等位基因频率的比较表2 宁夏回、汉族白癜风患者四个等位基因频率的比较表3 宁夏汉族患者与正常对照组四个等位基因频率的比较表4 宁夏回族白癜风患者与正常对照组四个等位基因频率的比较

　　3 讨论

　　目前国内外学者对HLA等位基因与白癜风的相关性研究进展迅速，但是关于白癜风相关HLA-DR、DQ等位基因的报道不同地区、不同种族结果不一。Burgos等[1]证实白癜风的易感基因位于人类染色体6P21.3-21.4上，而HLA基因区位于6P上。且有证据显示HLA复合体是机体对疾病易感的主要遗传成分，而HLA基因产物主要功能是参与免疫反应，因此，对HLA基因研究有助于阐明遗传因素在白癜风发病中的意义。先前人们对HLA进行血清学分型来研究HLA抗原与白癜风的相关性，发现具有种族差异性，如DRB1*04与墨西哥人白癜风[2] 具有正相关性，而DRB3*01与沙特阿拉伯人[3]白癜风具有负相关性。

　　王雪莹等[4]对中国吉林地区82例汉族白癜风患者HLA-DRB1等位基因进行检测发现患者组HLA-DRB1* 07和HLA-DRB1* 12等位基因频率比对照组明显增高，瞿斌等[5]研究发现寻常型白癜风患者中HLA-DQB1*02等位基因增高。而Tastan等[6]对土耳其白癜风患者研究后发现HLA-DRB1* 03、HLA-DRB1* 04、HLA-DRB1* 07基因频率比对照组明显增高。

　　宁夏回族自治区是回族人民的主要居住地，回族自癜风患者与HLA等位基因的相关性以及与汉族白癜风患者遗传易感性的可能差异目前在国内尚未见研究资料，本研究采用PCR-SSP方法，对宁夏地区回、汉族白癜风患者及正常对照组进行HLA-DQB1*02、HLA-DRBl*03、HLA-DRB1*07、HLA-DRBl*12位点基因频率比较后发现：HLA-DRBl*12可能是宁夏汉族白癜风的易感基因或与易感基因相连锁，这与王雪莹等[4]对吉林地区汉族白癜风患者的研究结果有共同之处，但亦有差异，表明与白癜风相关的易感基因可能因地域、环境的差异而不同。并且HLA-DRBl*12基因频率在回族正常人群中的分布(15.00%)较汉族正常人群(6.11%)显著增高，表明在漫长的历史演变中，宁夏回族可能始终保持着其基因遗传方面的独立性，对这一人群进行遗传学方面的研究将具有重要意义。但是通过对回、汉患者及回族患者与回族健康人群的基因频率分布进行比较后均未发现差异有统计学意义，我们认为即本研究所涉及到的四个等位基因的频率分布可能确实在二者之间差异不存在统计学意义，这就提示对其他HLA等位基因研究的必要性，再者可能与回族研究对象样本量过少有关。

　　本研究结果与国内外报道结果虽部分相同，但都存在一定差异，其原因可能是各个种族白癜风相关的HLA等位基因是不一致的[7]，另外大量研究表明，导致白癜风发病的不是单一的某基因，而是一些连锁基因的组合，因此本研究所涉及的与白癜风相关的某基因并不一定是本病的致病原因，而是与白癜风真正的致病基因存在连锁不平衡关系[6]。

　　本研究通过对宁夏回汉族寻常型白癜风患者HLA四个易感基因差异性研究，发现HLA-DRB1等位基因在白癜风的发病中起着重要作用。我们可以看到，明确某些HLA基因型与白癜风易感性的关系,一方面有助于白癜风的病因诊断，另一方面也有助于指导临床预防及治疗。

　　【参考文献】

　　[1] Arcos-Burgos M, Parodi E. Vitiligo: complex segregation and linkage disequilibrium analyses with respect to microsatellite locispanning the HLA [J]. Human Genetics,2002，110 (4):334-342.

　　[2] Orozco-Topete R, Córdova-López J, Yamamoto-Furusho JK,et al. HLA-DRB1 *04 is associated with the genetic susceptibility to develop vitiligo in Mexican patients with autoimmune thyroid disease[J]. Am Acad Dermatol, 2005,52(1):182-183.

　　[3] Abdullah Abanmi，Fahad Al Harthi,et al. Association of HLA loci alleles and antigens in Saudi patients with vitiligo[J]. Arch Dermatol Res,2006,298:347-352

　　[4] 王雪莹，姜日花，朱明姬，等.HLA-DRB1等位基因与吉林地区汉族白癜风和寻常型银屑病相关性研究[J].中国免疫学杂志,2008,24:144-146

　　[5] 瞿斌,许爱娥,赵玉铭，等.白癜风243例临床分析及与HLA-DQB1相关性研究[J].中华皮肤科杂志,2003,36:693-695.

　　[6] Tastan HB, AkarA, Orkunoglu FE,et al. Association of HLA class I antigens and HLA class II alleles with vitiligo in a Turkish popula-tion[J].Pigment Cell Res,2004,17(2):181-184

　　[7] 李强,高天文.白癜风遗传易感基因研究进展[J].中国皮肤性病学杂志,2004,18(9):568-569.