汉族散发性乳腺癌患者BRCA1基因突变的研究

　　【摘要】 目的 研究宁夏地区汉族乳腺癌患者BRCA1基因突变情况及突变位置。 方法 抽取已经确诊55例乳腺癌患者的外周血标本,对照组为30例健康女性查体的外周血标本,应用PCR法(聚合酶链反应)和DNA序列直接测定的方法检测BRCA1基因突变。结果 (1) 55例乳腺癌BRCA1的突变率9.09% (5/ 55) ,其中17例早发性乳腺癌 (≤35岁) BRCA1突变率23.53%(4/17) ，高于晚发性乳腺癌基因突变率的2.63%(1/38) ,差异有统计学意义(χ2 =3.94 , P< 0. 05) ;(2)5例BRCA1基因突变的乳腺癌中有3例ER、PR、人表皮生长因子受体2(HER-2)均为阴性，即三阴乳腺癌，其比例为60%(3/5),而非BRCA1突变的乳腺癌中三阴比例为10.00%(5/50)，差异有统计学意义(χ2=5.56 , P< 0.05) ;BRCA1基因突变相关性乳腺癌淋巴结转移率为100%(5/5)，高于非BRCA1基因突变相关性乳腺癌62%(31/50),差异有统计学意义(χ2 = 5.56，P<0.05 )。结论 BRCA1突变可能与宁夏地区汉族散发性乳腺癌尤其是早发性乳腺癌的发生密切相关，并与三阴乳腺癌有密切关系,且提示预后可能较差。

　　【关键词】 乳腺癌;BRCA1 基因;基因突变; DNA 序列测定; 三阴乳腺癌

　　Analysis of the mutation of BRCA1 gene in 55 Sporadic women breast cancer patients in Ningxia

　　YANG Yun-zhen, et al.(The Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To analyze the mutations of BRCA1 in patients with breast cancer in Ningxia.Methods By using polymerase chain reaction and direct DNA sequencing, BRCA1 mutations were detected in 55 women breast cancer cases and 30 cases of benign breast diseases.Results The frequency of BRCA1 mutation in 55 women breast cancer cases was 9.09 % (5/55). The frequency of BRCA1 mutation in women early onset breast cancer was 23.53 % (4/17), which was higher than that in late onset group (1/38, 2.36 %) (χ2=3.94, P<0.05); The frequency of estrogen receptor, progesterone receptor and human epidermal growth factor receptor negative (called triple-negative breast cancer) of BRCA1 mutation was 60% (3/5), which was higher than those in non BRCA1 mutation related breast cancer was 10.00%(5/50)(χ2=5.56, P<0.05), BRCA1 gene mutation-related breast cancer lymph node metastasis rate was 100% (5/5), higher than the non BRCA1-related breast cancer gene mutation 62% (31/50)(χ2=5.56, P<0.05).Conclusion The mutation of BRCA1 gene may be related to women breast cancer and early onset breast cancer, and also related with triple-negative breast cancer, and perhaps indicated poor prognosis.

　　[Key words] Breast cancer; BRCA1 gene; Gene mutation; DNA sequencing; Triple-negative breast cancer

　　肿瘤易感基因BRCA1是近年来乳腺癌的研究热点之一。据文献报道，欧美人群中家族性乳腺癌的BRCA1突变率较高，达45%左右[1]，而且突变率与家族中具有乳腺癌和卵巢癌病史的人数呈正相关。近年国内开展的几项研究多局限于小样本家族性分析[2]，对于散发性乳腺癌研究较少，且研究结果尚未发现中国人群中特有的突变位点。本文采用PCR及DNA序列直接测序法检测了宁夏地区55例散发的乳腺癌患者BRCA1基因的突变情况。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料：从2008年5月-2009年9月在宁夏医科大学附属医院住院的汉族乳腺癌患者中收集55例(经医院伦理委员会批准)，均经术后病理切片确诊为乳腺癌。对照组为30例汉族健康查体(女性)的外周血标本。所有血样均为外周静脉血，置于5ml含EDTA-2抗凝的试管中保存，血样保存于-80℃冰箱。病例中发病年龄28-71岁，平均年龄(44. 37±11. 58)岁。所有研究对象均无乳腺疾病史，在宁夏地区生活且无血缘关系的居民。以上研究对象为排除PCR扩增失败的样本。

　　1.2 方法：采用北京天根生化科技有限公司生产的DP318试剂盒提取外周血中的DNA。

　　1.3 引物：根据Genbank数据库(http ://www.ncbi.nlm.nih.gov)及外文资料[3],选取两个高频区域，由北京奥科生物技术有限公司合成引物。第一对引物扩增BRCA1 (GeneBank.L78833)第2号外显子，扩增产物258bp,引物如下：外显子上游5'- GAAGTTGTCATTTTATAAACCTTT- 3'，下游5'-TGTCTTTTCT TCCCTAGTATGT-3';第二对20外显子：上游5'-ACGTGTCTGCTCCAC-3', 下游5'-GGGAATCCAAATTACACAGC-3'，扩增产物为261bp。第三对引物扩增外显子11：上游5' -GCAACTGGAGCCAAGAAGAGTAAC-3'，下游5'-CCTGAGTGCCATAATCAGTACCAGG- 3'扩增产物为 319bp。

　　1.4 PCR 扩增：总反应体系25μl：内含DNA样品0.1μg，10mmol/L dNTP 0.8μl，10×PCR缓冲液( 含Mg2+)2.5μl，Taq DNA聚合酶2U，上下游引物终浓度各为0.33μmol/L，ddH2O补足反应体积至25μl。反应条件预变性:94℃3 min ,变性94℃45s ,退火57℃30 s ,延伸72℃1min ，35 个循环然后末轮循环72℃延伸10 min ，4℃保存，取PCR产物5μl经2.0 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.5 序列测定及分析：直接取PCR扩增产物5μl在2.0%琼脂糖凝胶电泳确定为单一亮条带，紫外线灯下切下扩增条带，凝胶纯化回收(天根纯化回收试剂盒)后送至天根(北京)生化科技有限公司进行正反向双向测序。结果与GenBank上的野生型cDNA BRCA1 ( U14680 )序列对照，判断有无基因突变，然后再将所检测到的BRCA1 突变位点，在乳腺癌信息中心网站数据库(Breast Cancer Information Core , BIC) 上对照,判定是核苷酸多态性位点、致病性突变位点,还是新发现的突变位点。

　　2 结果

　　2.1 55例乳腺癌患者基因突变检测结果：PCR扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶电泳检测均显示单一条带, 与对照组的相应片段长度一致。55例乳腺癌中发现有5例BRCA1的突变位点(表1)，其中2例在BIC(http://research.nhgri.nih.gov)上见报道，均为11号外显子2201C> T 突变。3例在BIC上未见报道，为本次研究新发现的突变位点。表1 55例乳腺癌中5例BRCA1基因突变检测结果

　　标本号发病年龄(岁)碱基序列变化突变点(位置)氨基酸改变乳腺癌病理类BIC报道335*139G>Texon2Arg to Leu浸润性导管癌否13342201C> Texon11Ser to Ser浸润性导管癌是1426*2201C> Texon11Ser to Ser浸润性导管癌是3333*5317A> Texon20Asp to Phe浸润性导管癌否55552403 A> Gexon11Arg to Asp浸润性导管癌 否 注：GeneBank 参照:BRCA1，U14680 ;BIC:乳腺癌信息中心数据库;*为三阴乳腺癌, Ser：丝氨酸, Arg:精氨酸, Leu: 亮氨酸,Phe：苯丙氨酸,Asp: 天冬氨酸

　　2.2 BRCA1基因突变相关性乳腺癌与非BRCA1基因突变相关性乳腺癌临床病理特点比较：见表2。BRCA1基因突变相关性乳腺癌三阴(ER、PR、Her-2均阴性)乳腺癌(3/5)比例高于非BRCA1基因突变相关性乳腺癌(5/50)，差异有统计学意义(χ2 =5.56，P< 0.05)。早发性乳腺癌突变率23.53%(4/17)明显高于晚发性乳腺癌突变率2.63%(1/38)，差异有统计学意义(χ2 =3.94，P< 0. 05)。BRCA1基因突变相关性乳腺癌淋巴结转移率为100%(5/5)，高于非BRCA1基因突变相关性乳腺癌62%(31/50)，差异有统计学意义(χ2 = 5.56，P<0.05 )。本次新发现的突变位点见图1、2、3(封3)。

　　2.3 对照组30例健康查体女性的外周血标本中未检测出BRCA1基因突变。表2 BRCA1相关乳腺癌临床病理特点

　　组别免疫组化三阴(%)非三阴(%)年龄(岁)≤35(%)>35淋巴结转移情况有无转移率(%)BRCA1基因突变相关性乳腺癌3(60.00)*2(40.00) 4(23.53)**150100***非BRCA1基因突变相关性乳腺癌5(10.00)45(90.00)13(2.63)37311962 注：两组比较：*χ2 =5.56，P< 0.05 ;**χ2 =3.94，P< 0. 05;***χ2 = 5.56，P<0.05

　　3 讨论

　　BRCA1基因组长约80kb，编码区5711bp，包括24个外显子，其中22个外显子编码一个含1863个氨基酸的蛋白质。大量的实验结果表明，BRCA1基因为抑癌基因, 其抑癌作用可能是通过其蛋白对其它基因的表达及细胞分化、增殖的调控实现的。本实验选择了欧美家系研究结果显示的BRCA1基因突变热点区域2、20外显子以及11号外显子的一段序列，利用PCR扩增和直接测序方法检测宁夏地区汉族散发性乳腺癌患者55例乳腺癌患者外周血的BRCA1突变情况。

　　国外研究显示[4-6] 表明，约75 %的家族性乳腺癌—卵巢癌患者中发现有BRCA1基因的突变。BRCA1基因突变主要有3种类型: (1) 移码突变，是由于碱基的插入或缺失引起，可导致读码框移位，从而导致蛋白截短和基因功能改变其结果引起密码子易位扰乱基因信息，产生无意义蛋白;(2)错义突变，即突变发生在编码基因,改变了进化上高度保守的氨基酸;(3)无义突变，是单个碱基的改变，产生终止密码子， 致蛋白翻译的中断，使氨基酸肽链截短。这些突变都将导致蛋白质合成改变，影响蛋白功能从而可能导致肿瘤的发生[7]。移码突变和无义突变这两种突变都被认为有致病意义，占致病性突变的60%-70%，同时还有一部分错义突变和单核苷酸多态性与发病有关。

　　国外研究报道[8-9]，BRCA1相关乳腺癌与组织病理学、高增殖性、低分化性、非整倍体性、P53高频率的过度表达及ER、PR阴性等不良预后指标相关，BRCA1相关乳腺癌病理类型中髓样癌比例高于BRCA1阴性乳腺癌。

　　本研究检测宁夏地区55例汉族散发性乳腺癌患者共发现5例基因突变，有3例BIC(乳腺癌信息网站)上未见报道，是本次研究新发现的突变位点。其中1例20号外显子发生5317A> T突变，此位点未在BIC上报道，该患者在手术4个月后发生锁骨上淋巴结转移和颈部淋巴结转移，对化疗效果不敏感，且免疫组化类型为三阴乳腺癌，推测可能与BRCA1基因突变有关。另外2例为11号外显子2403 A> G和2号外显子139G>T，后者测序图中显示双峰，可能是致病的SNP(单核苷酸多态性)导致乳腺癌的发生，有待于进一步的研究。本研究发现BRCA1突变的乳腺癌中三阴率高于非BRCA1突变相关性乳腺癌，且BRCA1相关性乳腺癌发病年龄早于非BRCA1相关性乳腺癌，淋巴结转移率高。但发生基因突变的乳腺癌病理类型均为浸润性导管癌，与文献报道不一致，可能与病例数少有关。综上所述，本研究显示BRCA1突变与宁夏地区汉族早发性乳腺癌密切相关，且淋巴结转移率高，提示预后较差。

　　【参考文献】

　　[1] Irminger - Finger I, Siegel BD, Leung WC. The functions of breast cancer susceptibility gene 1 (BRCA1) product and its associated proteins[J]. Biol Chem,1999, 380(2): 117-128.

　　[2] 周远征，孙强，林守清，等.中国汉族乳腺癌家系中BRCA1和BRCA2基因的胚系突变[J].中华医学杂志, 2004，84 (4) : 294-281.

　　[3] Annika Bergman, Anna Flodin, Yvonne Engwall, et al. A high frequency of germline BRCA1 /2 mutations in western Sweden detected with complementary screening techniques[J]. Familial Cancer,2005, 4 ( 2) : 89–96.

　　[4] Philippe Maillet, PO，M，et al.Twenty - three novel BRCA1 and BRCA2 sequence variations identified in a cohort of Swiss breast and ovarian cancer families[J]. Cancer Genetic and Cytogenesis, 2006, 169 ( 1) :62- 68.

　　[5] Nielsen TO,Hsu FD,Jensen K,et al. Immunohistochemical and clinical characterization of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma[J].Clin Cancer Res,2004,10(16):5367-5374.

　　[6] Banerjee S,Reis-Filho JS,Ashley S,et al.Basal-like breast carcinomas:clinical outcome and response to chemotherapy [J].J Clin Pathol,2006,59(7):729-735.

　　[7] William DF, Kelly M, Sun P, et al.Estrogen receptor status in BRCA1 and BRCA2-Related breast cancer: the influence of age, grade, and histological type[J].Cancer Res, 2004，10:2029-2034.

　　[8] José P, Emiliano H, Ana O, et al.Immunohistochemical characteristics defined by tissuemicroarray of hereditary breast cancer not attributable to BRCA1 or BRCA2 mutations: differences from breast carcinomas arising in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers[J].Cancer Res, 2003，9: 3606-3610.

　　[9] Cipollini G, Tommasi S, Paradiso A, et al.Genetic alterations in hereditary breast cancer[J].Ann Oncol, 2004，15: 13-71.