槐定碱致痫大鼠海马组织超微结构的观察

　　【摘要】 目的 建立槐定碱(sophoridine，SRI)致痫大鼠癫痫模型，电镜下观察槐定碱致痫大鼠海马组织超微结构的变化，探讨癫痫发病机制。 方法 将30只成年SD大鼠(雌雄不拘)随机分为生理盐水对照组(NS)、槐定碱致痫组(SRI)、苯巴比妥钠﹢槐定碱组(PBS+SRI)，每组各10只。腹腔注射大剂量槐定碱(47.83mg/kg)后，观察大鼠行为学变化以及应用电镜技术观察各组大鼠致痫后海马CA1区和CA3区神经元组织病理学和形态学的改变。结果 腹腔注射大剂量槐定碱后，大鼠出现了痫性行为发作;电镜下可见槐定碱致痫大鼠海马CA1区和CA3区神经元核膜双层结构破坏,神经细胞核严重固缩,染色质颗粒状聚集,线粒体肿胀,嵴断裂或消失,毛细血管内皮细胞核固缩。经苯巴比妥钠干预后，槐定碱致痫大鼠海马CA1区和CA3区神经细胞的损伤程度减轻。结论 大剂量槐定碱可导致大鼠在体海马神经细胞损伤，从而诱发癫痫。

　　【关键词】 槐定碱;癫痫;大鼠;海马;超微结构

　　Observation on ultrastructure of morphological deformation on hippocampus in SRI induced epileptic rat

　　CHEN Xiao-xia, ZHANG Lin-Na, DUAN Hui-yun, et al.(Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To establish a sophoridine (SRI) induced epileptic rats model to observe ultrastructure of morphological deformation on hippocampus in SRI induced epileptic rat.Methods Sprague Dawley rats were randomly divided into saline- control group (n=10), SRI group (n=10) and sodium phenobarbital (PBS)+ SRI group (n=10). Model group was injected with Sophoridien intracerebroventricularly (i.c.v.); saline-control group was injected with physiological saline as model group; sodium Phenobarbital was injected with Phenobarbital after using Sophoridien for 0.5 hour. SRI was intraperitoneally injected in rats and to observe the changes of rat's behavior. Then ultrastructure of morphological deformation of neurons in CA1 and CA3 of hippocampus in saline- control group, SRI group and sodium phenobarbital (PBS) + SRI group rats were observed through electron microscope. Results The kindling model of rats was induced by intraperitoneal injection of SRI. The behavioral seizure was observed, sings of mitochondrial damage, organelle burst and degeneration of synapses were seen at SRI administration; Neurons of PBS+ SRI group were less damages as compared with those of SRI group and most neural structure was undamaged. Conclusion sophoridine can cause hippocampal neurons from being damaged by epileptic seizures in vivo.

　　[Key words] Sophoridine; Ultrastructure; Hippocampus

　　癫痫是由多种病因所致的发作性疾病，其发病机制复杂，很多机制至今不明。而对于人类来说，人脑的特殊性使人类癫痫的研究还存在很大困难。因此，建立能模拟人类癫痫发作的实验动物模型对于癫痫研究至关重要。近年来，本研究室发现槐定碱(SRI)可导致大鼠出现痫样放电[1]，因此利用槐定碱建立了一种全身性发作的癫痫动物模型，在本研究中，我们通过观察槐定碱(最佳剂量为47.83mg/kg)引起大鼠癫痫发作的行为表现、癫痫发作的潜伏期、发作程度、发作持续时间及海马神经元超微结构的变化，进一步评价槐定碱点燃癫痫模型的效应，从而探讨癫痫的发病机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂： 日立H-600电镜(日本日立公司);BMJ-Ⅲ型组织包埋机(常州市郊区中威电子仪器厂);PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪(常州市郊区中威电子仪器厂);78HW-1 型恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司);槐定碱(宁夏盐池药厂，批号为021180);苯巴比妥钠(上海新亚药业有限公司，批号为040603);多聚甲醛(北京益利精细化学品有限公司，分析纯，批号为20020203)。

　　1.2 实验动物及分组：健康成年Sprague-Dewley(SD)大鼠(雌雄不拘)30只，体重180-220g(由宁夏医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(宁)2005-001，随机分为生理盐水对照组(NS)、槐定碱致痫组(SRI)，苯巴比妥钠﹢槐定碱组(PBS+SRI)，每组各10只。

　　1.3 动物模型制备及大鼠惊厥分级：槐定碱致痫组大鼠腹腔注射槐定碱(47.83mg/kg)，而生理盐水对照组大鼠腹腔注射相同容量的生理盐水，苯巴比妥钠﹢槐定碱组预先腹腔注射苯巴比妥钠20mg/kg,0.5 h后按上述剂量(47.83mg/kg)腹腔注射槐定碱，观察大鼠行为表现，连续观察2h(超过此时间，癫痫一般不再发作)。观察指标：①潜伏期：从腹腔注射SRI到大鼠首次出现痫性发作的时间为潜伏期;②发作持续时间：大鼠痫性发作达Ⅳ级及以上后所持续的时间;③发作程度。按照Racine分级标准[2]，将动物痫性发作的表现分为0级：无任何反应;Ⅰ级：面部抽搐及咀嚼;Ⅱ级：点头和(或)甩头;Ⅲ级：前肢阵挛;Ⅳ级：前肢阵挛伴伸直;Ⅴ级：前肢及全身阵挛，失去平衡，跌倒。Ⅲ级及以下为轻型发作，Ⅳ级及以上为重型发作。Ⅳ级以下判定为无效，表现为轻型发作[2]。

　　1.4 电镜观察：以上各组大鼠于相应时间点经腹腔注射20% 乌拉坦(0.5g/kg)麻醉后迅速开胸暴露心脏，沿左心室向升主动脉插管并固定，右心耳剪一小口，先快速灌入生理盐水300ml充分冲洗血液，然后换4%多聚甲醛戊二醛混合溶液500ml约1h 进行组织固定，见四肢、尾阵挛直至僵直表明灌注良好。断头取脑，切取海马CA1区和CA3区部位3mm×3mm×3mm的脑组织，将其放入0.1mol二甲砷酸钠缓冲液中冲洗后保存在2%-2.5%的戊二醛固定液中2h。再换为0.1mol二甲砷酸钠缓冲液漂洗3次，每次间隔2h，过夜保存在4℃冰箱，用于电镜观察。

　　2 结果

　　2.1 行为学表现：生理盐水对照组大鼠活动正常,无癫痫样发作行为表现。槐定碱致痫组大鼠腹腔注射槐定碱后,大鼠由活动状态逐渐变得安静,随后出现呆滞,部分动物出现呼吸急促，经(8.46±1.62)min的潜伏期后,大鼠逐渐出现癫痫样发作表现。开始出现须动、点头、咀嚼样动作，尾巴翘起,湿狗样抖动, 伴流涎,呈阵发性,至0.5h左右开始有面肌抽动、双前肢抬起阵挛或单肢抽搐,随后出现姿势失衡，跌倒，阵挛抽搐，继之发生全身强直，大鼠口吐白沫，嘴唇、四肢皮肤发绀，甚至尿失禁，持续(36.84±5.69)min，反复发作,抽搐缓解后，大鼠可自由活动，2h 后大部分动物停止发作，点燃率达100%(10/10)，达到Ⅳ级以上发作的成功率为80%(8/10)，2只死亡，死亡率为20%。经苯巴比妥钠干预后，槐定碱致痫大鼠主要为0级和Ⅰ级痫性发作表现，癫痫样发作潜伏期延长至(35.83±6.65) min(P<0.05)，如表1、2所见。表1 槐定碱对大鼠痫样发作潜伏期表2 槐定碱对大鼠癫痫发作程度的影响

　　2.2 电镜观察

　　2.2.1 生理盐水对照组：大鼠海马CA1区和CA3区神经细胞核膜、核仁结构清晰，胞核内染色质分布均匀，细胞质内细胞器丰富，可见完整的线粒体、高尔基体和粗面内质网;突触结构正常，突触间隙清楚;毛细血管的内皮细胞核呈长椭圆形，核膜结构清晰，染色质均匀，见图1-2(目录后)。

　　2.2.2 槐定碱致痫组：槐定碱致痫后大鼠海马CA1区和CA3区神经细胞核严重固缩,核膜内陷，粗面内质网扩张,有大量的突触，突触间隙模糊，可见毛细血管数量多，部分毛细血管的内皮细胞核固缩，毛细血管壁增厚，见图3-4(目录后)。

　　2.2.3 苯巴比妥钠+槐定碱组：大鼠海马CA1区和CA3区神经细胞核膜双层结构较清楚。大多数细胞结构正常，少部分细胞有灶性细胞核固缩，见图5(目录后)。

　　3 讨论

　　3.1 槐定碱致痫大鼠模型的建立:SRI是从豆科槐属植物苦豆子中分离提纯出来的一种生物碱，动物实验研究表明,SRI能够显著拮抗戊巴比妥钠引起的催眠作用,具有明显的中枢兴奋作用[3]。在本实验中，我们观察了槐定碱引起大鼠癫痫发作的行为表现及癫痫发作的潜伏期、发作程度、发作持续时间。实验结果显示：槐定碱组大鼠经(8.46±1.62)min的潜伏期后出现癫痫样发作，可出现凝视、湿狗样抖动、阵发性头面部肌肉抽搐,如眨眼、咀嚼、流涎,类似人类癫痫的自动症,继之前肢阵挛、后肢站立,并出现全面强直阵挛发作,最终出现癫痫持续状态。从发作表现来讲,类似于人类的复杂部分性发作,之后继发为全面性发作，即发作由I、II、III级(Racine分级,部分性发作)向IV、V级(Racine分级,全身性发作)发展,其中 I级和II级之间会有交叉，III级和IV级之间也有交叉。点燃率达100%，死亡率为20%。经传统的抗癫痫药苯巴比妥钠干预后，槐定碱致痫大鼠仅表现为0级和Ⅰ级痫性发作，且发作潜伏期延长。提示槐定碱致癫痫模型是一简便、稳定、与人类癫痫相似的急性癫痫模型，此模型在行为学上具有以下优点:① 制作简便、成本低、致痫潜伏期短,致痫率高，死亡率低。② 致痫过程清晰,痫性发作的分级容易确认，并在解除痫性发作后状态良好。

　　3.2 槐定碱诱发大鼠急性癫痫发作后海马的损害:癫痫发作带来的主要危害之一是对脑神经细胞的损害,而海马神经元的损伤和脱失在癫痫(尤其是颞叶癫痫)的发生中起着关键性作用,两者存在互为因果关系[5]。研究表明，海马神经元内细胞器的数量很多，属于代谢率较高的神经元，对癫痫发作所继发一过性的缺氧、低血糖和脑水肿非常敏感，因此海马结构(尤其是CA3和CA1区)成为痫性发作神经元易损伤脑区，也常作为脑痫性损害研究对象。CA1区分子层是锥体细胞顶树突存在的部位，CA3区的神经元发出Schaffer侧支和来自内嗅皮层的穿通纤维在此区域与CA1区神经元形成广泛的突触联系。而突触又是神经元代谢最旺盛的部位，其功能的改变必然引起代谢水平的变化，以及随之而来的血供需求的变化。此外，研究报道线粒体与癫痫关系密切，线粒体的功能障碍可导致癫痫发作，癫痫发作亦可损伤线粒体[7]。

　　本实验中电镜观察到SRI诱导癫痫发作引发海马CA1区和CA3区严重损伤，表现为神经细胞发生不同程度的变性坏死、核固缩，微血管扩张、内皮细胞变性，说明海马各区血流分布差异参与了海马痫性损伤。电镜亦观察到线粒体嵴断裂并发展为空泡样变性，说明线粒体氧化应激功能障碍是长时间癫痫发作的结果，并在癫痫发作后的脑损伤中发挥重要作用。苯巴比妥钠是传统的抗癫痫药物，电镜下观察到苯巴比妥钠+槐定碱组大鼠海马神经元损害程度较槐定碱致痫组轻，提示槐定碱具有致癫痫作用。

　　【参考文献】

　　[1] 张琳娜,陈晓霞，白洁，等.槐定碱对青霉素致痫大鼠中枢活动的影响[J].宁夏医学院学报，2008,30(6):703-705.

　　[2] Racine RJ,Steingart M,Mcintyre DC.Development of kindling-prone and kindling-resistantrants:selective breeding and electrophysiological studies[J].Epilepsy Res，1999，35(3)：183-195.

　　[3] 钟仁山.苦豆子的研究及应用[M].银川：宁夏人民出版社,1983.9.

　　[4] Loscher W.Animal models of intractable epilepsy[J].Prog Neurobiol,1997,53(2):239-258.

　　[5] Halonen T, Nissinen J, Pitkanen A.Effect of lamotrigine treatment on status epilepticus-induced neuronal damage and memory impairment in rat[J].Epilepsy Res,2001,46(3):205-223.

　　[6] Henshall DC, Chen J.Involvement of caspase-3-like protease in the mechanism of cell death following focally evoked limbic seizues [J]. J Neurochemistry,2000,74 (3):1215-1223.

　　[7] Kudin AP,Kudina TA,Seyfried J,et al.Seizure-dependentmodulation of mitochondrial oxidative Phosphorylation in rat hippocampus[J]. Eur J Neurosci，2002,15:1105-1114.