CpG甲基化调节神经黏附分子多聚唾液酸的合成

　　【摘要】 目的 探讨DNA甲基化是否能够用来作为多聚唾液酸(PSA)表达的基因外调控。方法 用甲基化PCR分析成年小鼠和18d的胚胎鼠(E18)大脑不同区域合成多聚唾液酸的酶的基因- mST8SiaIV(PST)和mST8SiaII(STX)启动子甲基化水平;用dot-blotting分析不同浓度的甲硫胺酸和丙戊酸对PSA表达的影响;用CBRA(Combined bisulfite restriction analysis)进一步确认基因- ST8SiaIV和mST8SiaII启动子甲基化水平，神经细胞和神经胶质的原代培养。结果 (1)胎儿鼠与小鼠的大脑、小脑、基底核和海马，甲基化特异性的PCR结果显示：STX基因转录起始区没有甲基化，PST基因转录起始区在18d的胎儿鼠的所有4个区域和成年鼠的2个区域-大脑和小脑都有甲基化。(2)甲基化特异性的PCR分析原代培养的神经细胞和神经胶质细胞STX基因未发生甲基化，但是在PST基因在神经胶质细胞发现轻微的甲基化。(3)小鼠神经纤维母细胞瘤细胞株-Neuron2A细胞的PST基因启动子几乎完全被甲基化。(4)不同浓度甲硫氨酸处理Neuron2A细胞，PSA表达下降;相反丙戊酸增强了PSA的表达。结论 甲基化能够用来作为多聚唾液酸表达的基因外调控，多聚唾液酸表达的基因外调控可能与突触的形成和记忆的形成有关。

　　【关键词】 多聚唾液酸;DNA甲基化;基因外调控;突触

　　Polysialylation of neural cell adhesion molecule can be regulated by CpG methylation

　　GAO Yong-ying, CAI Hai-yan WANG Wei.(Ningxia People's Hospital, Yinchuan 750021, China)

　　[Abstract] Objective To explore the methylation could be used for epigenetic regulation of PSA expression or not. Methods Methylation-specific PCR was used to analyze the promoter methylation level of mST8SiaIV (PST) and mST8SiaII (STX) which were known as enzymes to synthesize polysialic acid (PSA). Using dot-blotting to assay expression of PSA on the surface of Neuron2A treated by methionine and valproic acid at different concentration. CBRA (Combined bisulfite restriction analysis) was used to confirm the promoter methylation level of PST and STX, and primary culture of neuronal and glial cells. Results STX promoter was not methylated, but PST promoter was methylated in all four region of E18 and in two region of adult mouse brain; In primary cultured neuronal and glial cells, no methylation could be detected in STX gene, but slight methylation in PST gene in glial cells; In mouse neuroblastoma cell line, Neuro2A cells, most of the promoters of PST gene were methylated; Neuro2A cells treated by methionine or valproic acid, methionine slightly decreased the PSA expression, whereas valproic acid significantly increased. Conclusion Methylation can be utilized for epigenetic regulation of PSA expression. Epigenetic regulation of PSA may be associated with synaptic plasticity, or memory formation.

　　[Key words] Polysialic acid neural cell adhesion molecule; DNA methylation; Epigenetics; Synaptic plasticity

　　多聚唾液酸(PSA)是线形同聚物构成的多糖，其作用是通过神经细胞黏附分子(NCAM)介导。因此，描述PSA时，通常以PSA-NCAM的形式。PSA-NCAM在整个神经系统的发育过程中都有重要作用，如神经前体细胞的迁移[1]，神经细胞的分化，突触的可塑性和空间记忆的形成[2]，轴突旁路的形成[3]。本研究通过在基因水平和蛋白水平对能催化PSA合成的两种多聚唾液酸转移酶- ST8SiaII(STX)和 ST8SiaIV(PST)研究发现，调控这两种酶表达的基因转录起始区富含GC，而且还包含SP-1蛋白识别序列，同时这个识别序列也包含了CpG 序列[4]，甲基化能够用来作为多聚唾液酸表达的基因外调控。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料：组织基因组DNA提取试剂：QIAGEN公司(JP);细胞基因组DNA提取试剂：GENTRA 公司(USA);鼠抗 PSA-NCAM单克隆抗体：CHEMICON INTERNATIONAL，Inc(USA)。免疫纯化的生物素连接的山羊抗鼠 IgG+IgM抗体：Pierce Biotechnology，Inc(USA)。18d的胚胎鼠(E18)和成年小鼠C57BL/6J(山犁大学医学部动物研究中心)各50只，体重分别为100-250g。小鼠Neuron2A细胞株：山犁大学医学部环境遗传医学教室。胎牛血清和dulbeccos modified eagles medium(DMEM)来自SIGMA公司。蛋白定量试剂盒：Dojindo Molecular Technologies，Inc(JP);WizardTM DNA clean-up System：promega 公司。其他试剂购自SIGMA公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠神经纤维母细胞瘤的细胞株-Neuro2A，细胞培养及神经细胞和神经胶质细胞的原代培养：小鼠成纤维母细胞瘤的细胞株-Neuro2A，细胞常规复苏后,以104/cm2的密度接种于培养皿，培养液含10%(v/v)胎牛血清和青霉素/链霉素(100μg/ml)的DMEM，置37℃，5% CO2培养箱中培养。细胞培养24h后，加入终浓度为1mM的视黄酸(retinoic acid)，48h后观察细胞的分化情况，细胞80%融合后传代。再加入不同浓度的丙戊酸和甲硫氨酸，48h后收集细胞，提取蛋白。

　　1.2.2 神经细胞和神经胶质细胞的原代培养：取18d的胚胎鼠(C57BL/6J)大脑皮层细胞分别培养在神经细胞培养液和神经胶质细胞培养液，大约2周后，细胞呈现互相连接生长。分别收集神经细胞和神经胶质细胞，提取蛋白。

　　1.2.3 蛋白提取：分别收集Neuro2A，神经细胞和神经胶质细胞，冷PBS洗涤细胞3次，用预冷的细胞裂解液(1% Triton X-100和1%的蛋白酶抑制剂)100μl裂解细胞(5000rpm，5min)，超声波使溶液均匀透明 ，考马斯亮蓝(lowry)法测定蛋白浓度。

　　1.2.4 DNA提取：分离成年鼠和胚胎鼠的大脑、小脑、基底核、海马，加入Proteinase K，55℃过夜消化，苯酚—氯仿抽提，酒精沉淀，干燥， TE溶解，紫外分光光度仪测量DNA浓度。

　　分别收集Neuro2A，神经细胞和神经胶质细胞，冷PBS洗涤细胞5次，加入细胞裂解液，震荡，再经过RNase A处理和蛋白沉淀，异丙醇抽提，酒精沉淀，TE溶解，紫外分光光度仪测量DNA浓度。

　　1.2.5 PSA合成的甲基化分析—甲基化特异性的PCR (methylation-specific PCR)：上述提取的DNA，经过亚硫酸盐处理后作为模板进行PCR扩增反应，引物的设计围绕SP-1蛋白结合位点(引物序列见表1)。采用甲基化特异性的PCR 检测了STX和PST基因转录其始区是否发生甲基化[5]。表1 甲基化特异性PCR引物设计

　　引物名称引物序列，5-3产物大小(bp)ST8iaII-M forGGTTTGGGTTTATAAATGGGATAGAGATGATC305ST8iaII-M revAACAAACGCCTAACGTCGCTCGST8iaII-U forGGTTTGGGTTTATAAATGGATAGAGATGATT 313ST8iaII-U revAACTACTTAACAAACACCTAACATCACTCAST8iaIV-M forGAAGTTGGCGGATTTGGAGTTTTGGAC225ST8iaIV-M revAAACCAACCAATCACCGTACTAAAAAAACGST8iaIV-U forGTTGAAGTTGGTGGATTTGGAGTTTTGAT 230ST8iaIV-U revCAAAACCAACCAATCACCATACTAAAAAAACA1.2.6 COBRA(combined bidulfite restriction analysis)：用来进一步确定mST8SiaIV(PST)基因的甲基化。经过亚硫酸盐处理的DNA为模板，引物的设计不同于甲基化特异性的PCR，COBRA的PCR引物中不包含CpG二核苷酸，因此在扩增的步骤中模板与模板之间不会再有区别。mST8SiaIV(PST)基因的扩增体系为：mST8SiaIV(PST)35个循环，94℃30s，62℃30s，72℃30s，最后72℃延长10min。3%琼脂糖凝胶溶于1×TAE(TAE=1M Tis.HCL, 1.14ml Ammonium Acetate, 0.01M EDTA,pH8.0)电泳液，100V，30min。再用剩余的PCR产物17μl，NE buffer 2μl，BstU1限制性核酸内切酶1μl，总反应体系是20μl，反应时间1h，反应温度37℃。然后再用3%琼脂糖凝胶溶于1×TAE(TAE=1M Tis.HCL, 1.14ml Ammonium Acetate, 0.01M EDTA,pH8.0)电泳液，SYBR Gold染色，100V，30min。

　　1.2.6 斑点印记:用促进DNA甲基化的甲硫氨酸或者使用DNA甲基化抑制剂依赖于转录抑制的丙戊酸处理Neuron2A细胞，处理后48h，收集细胞, 用稀释的细胞裂解液将不同浓度的蛋白样本点倒在斑点印记装置上(BIORAD)的硝化纤维膜(ATTO)上，随后用溶于1×PBS 1%的脱脂奶粉封闭硝化纤维膜1h，再加入抗-聚唾液酸-神经细胞黏附分子抗体，4℃过夜。硝化纤维素膜用生物素连接的抗-鼠IgM抗体，然后用抗生素蛋白过氧化物酶混合试剂(Nacalai Tesque)法进行检测。发色反应采用ECL试剂，而且用化学发光器定量发光(BioRad)。

　　2 结果

　　2.1 甲基化特异性的PCR结果：胚胎鼠和小鼠的大脑、小脑、基底节和海马显示STX基因转录起始区没有甲基化，PST基因转录起始区在18d的胎儿鼠的所有4个区域和成年鼠的2个区域-大脑和小脑都有甲基化，所分析的4个胎儿鼠和4个成年鼠标本都显示了相似的结果。

　　2.2 原代培养的神经细胞和神经胶质细胞：PST基因转录起始区的甲基化是否具有细胞特异性， STX基因未发生甲基化，但是在PST基因在神经胶质细胞发现的轻微的甲基化。在小鼠神经纤维母细胞瘤细胞株-Neuron2A细胞的PST基因启动子分析中发现，启动子几乎完全被甲基化(图1、2，见封二)。

　　2.3 利用Neuro2a细胞PST基因甲基化的启动子作为一种神经学方面的模型进行了进一步分析:用增加DNA甲基化的甲硫氨酸[6]，或者使用DNA甲基化抑制剂依赖于转录抑制的丙戊酸处理的Neuro2a细胞[7]，处理后48h，用斑点印记法分析了聚唾液酸的表达。发现甲硫氨酸轻微的降低聚唾液酸的表达，但是丙戊酸明显地增加了聚唾液酸的表达。结果显示，用10mM甲硫氨酸处理过的细胞，在总蛋白为0.63μg/ml时，多聚唾液酸的表达降低到大约60%。另一方面，在用10mM丙戊酸处理的细胞，总蛋白为0.63μg/ml时，多聚唾液酸的表达增加到超过200%。

　　2.4 COBRA:用来进一步确定mST8SiaIV(PST)基因的甲基化(图3，见封二)。

　　3 讨论

　　CpG 双核苷酸的甲基化和去甲基化在哺乳动物的基因表达中有重要的调控作用。真核生物的基因调控包括DNA水平，转录水平，转录后，翻译水平及翻译后调控五种形式。而转录水平调控中有碱基修饰作用，DNA中主要的修饰碱基是5-甲基胞嘧啶(5mC)。DNA中的5mC大约90%以上在其3’端与鸟嘌呤(G)相邻，所以常以5mCpG的形式出现。

　　PSA-NCAM的表达调控是一个复杂的机制。从本文研究结果表明，PSA的表达可能受CpG甲基化的调控。研究结果表明，PST基因转录起始区在胚胎鼠体内可能被甲基化，但是随着神经系统的发育成熟，甲基化发生了变化，只在大脑和小脑中存在甲基化，而基底核和海马甲基化消失。这个现象说明在生物进化过程中，DNA甲基化在神经系统的发育起重要的调控作用。但是在神经细胞和神经胶质细胞的原代培养，PST基因在神经胶质细胞发现少许甲基化，提示基因外调控-CpG甲基化在大脑的高级功能，如与记忆的形成有很大关系。但是在小鼠成纤维母细胞瘤细胞株-Neuron2A，PST基因启动子有高度的甲基化，甲硫氨酸和丙戊酸作用的不一致性是合理的，故可得出这样的结论：PST基因启动子甲基化可能促进基因外的调控。最近，有丙戊酸增加聚唾液酸表达的报道，而且在人类肿瘤细胞，只增加PST mRNA的表达，而没有增加STX mRNA的表达[8]。这个报道支持了我们的发现。众所周知，在胚胎时期，多聚唾液酸的合成，STX基因的表达是主要的，而出生以后，PST基因的表达是主要的[9]。因此，多聚唾液酸的基因外调控在出生后比在胚胎时期对于突触形成可能更为重要。

　　总之，与突触形成有关的分子多聚唾液酸的表达可能受PST基因启动子甲基化的调控。新的研究表明，大脑异常DNA甲基化可能促进神经系统的异常,例如精神分裂症[1]，双极病变[1]和自闭症都有报道。另一方面，多聚唾液酸的过度表达能诱导神经通路的异常。本项研究结果表明多聚唾液酸表达的精确调控—基因外调控，可能有助于正常大脑发育的形成，有待进一步深入研究。

　　【参考文献】

　　[1] Abdolmaleky HM, Smith CL, Faraone SV, et al. Methylocics in psychiatry: modulation of gene-environment interactions may be through DNA methylation[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet,2004,127:51-59.

　　[2] G Becker C, Artola A, Gerady-Schahn R, et al. The polysialic acid modification of the neural cell adhesion molecule is involved in spatial learning and hippocampal long-term potentiation[J].J Neurosic Res.1996,145:143-152.

　　[3] Bruses JL,Rutishauser U. Roles regulation and mechanism of polysialic acid function during neural development[J].Biochimie,2001,83:635-643.

　　[4] Takashima S, Yoshida Y, Kanematsu T, et al. Genomic structure and promoter activity of the mouse polysialic acid synthesis (mST8Sia IV/PST) gene[J].J Biol Chem,1998,273:7675-7683.

　　[5] Sakashita K, Koike K, Kinoshita T, et al.Dynamic DNA methylation change in the CpG island region of p15 during human myeloid development[J]. J Clin Invest,2001,108:1195-1204.

　　[6] Tremolizzo L, Carboni G, Ruzicka WB, et al. An epigenetic mouse model for molecular and behavioral neuropathologies related to schizophrenia vulnerability[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:17095-17100.

　　[7] Manev H and Uz T. DNA hypomethylating agents 5-aza-2’-deoxycytidine and valproate increase neuronal 5-lipoxygenase mRNA[J]. Eur J Pharmacol,2002,445:1611-1617.

　　[8] Beecken W D, Engl T, Ogbomo H, et al. Valproic acid modulates NCAM polysialylation and polysialyltransferase Mrna expression in human tumor cells[J].Int Immunopharmacol,2005,5:757-769.

　　[9] Angata K, Fukuda M. Polysialyltransterases: major players in polysialic acid synthesis on the neural cell adhesion molecule[J].Biochimie,2003,85:195-206.