黄芪和秦艽提取物抗甲型流感病毒研究

　　【摘要】 目的：评价中药黄芪和秦艽提取物混合液抗甲型流感病毒的作用。方法：⑴复制小鼠肺部甲型流感病毒感染模型56只，随机分为病毒对照组(NS，n=9)、利巴韦林组(0.1 g/kg,n=11)、黄芪组(0.5 g/kg,n=12)、秦艽组(0.5 g/kg,n=12)及混合提取物组(0.5 g/kg,n=12),给药4 d后处死计算肺指数和抑制率;⑵另40只模型，随机均分为病毒对照组、黄芪组、秦艽组及混合提取物组，给药14 d后计算各组死亡保护率和延长生命率。结果：⑴利巴韦林组、黄芪组、秦艽组及混合提取物组肺指数抑制率均显著高于正常对照组和病毒对照组(P<0.05或P<0.01);⑵黄芪组和混合提取物组小鼠平均存活天数明显高于病毒对照组(P<0.05或P<0.01)。两项实验中均是混合提取物组效果最为明显。结论：黄芪和秦艽混合提取物具有明显的抗甲型流感病毒作用，效果优于单独的黄芪和秦艽。

　　【关键词】 黄芪;秦艽;甲型流感病毒;药效学

　　Effects of Mixed Astragalus Membranaceus and Gentiana Extracts on Inhibiting Influenza A Virus ZHANG Chuanjie1,LIU Lijuan2,ZHANG Penghua3,LI Jingfeng1* ( 1Children Medical Center,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000;2Faculty of Basic Medicine,Wuhan University;3Institute of Clinical Pharmacy,Department of Pharmacy,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China;)

　　Abstract:Objective To investigate the effects of mixed astragalus membranaceus and gentiana extracts against influenza A virus. Methods ⑴The influenza A virus infected model were prepared 56 mice were randomly diveded into virus control group(NS，n=9),ribovirin group(0.1 g/Kg,n=11)、astragalus membranaceus group(0.5 g/Kg,n=12),gentiana group(0.5 g/Kg,n=12)and mixed extracts group(0.5 g/Kg,n=12),the lung index and inhibition rate of it were calculated after administration for 4 days,and another 10 mice were enrolled as control group;⑵The other 40 influenza A virus infected mice model were randomly diveded into virus control group,astragalus membranaceus group,gentiana group and mixed extracts group,the death protective rate and prolong survival rate were calculated after administration for 14 days.Results ⑴The inhibition rate of lung index in ribovirin group,astragalus membranaceus group,gentiana group and mixed extracts group were all significantly higher than that of both control and virus control group(P<0.05 or P<0.01);⑵the average survival days in astragalus membranaceus group and mixed extracts group were all significantly higher than that of virus control group(P<0.05 or P<0.01).The effects of mixed extracts group was the most obviously in the two experiments.Conclusion The mixed astragalus membranaceus and gentiana extracts could effectively inhibit influenza A virus and the effect was superior to any single extract.

　　Key words:Astragalus Membranaceus;Gentiana;Influenza A virus;Pharmacodynamics

　　黄芪(Astragalus membranaceus)为常用的传统中药，具有很好的提高机体免疫力和抗病毒作用[1-2]。现代药理学研究表明黄芪具有辛凉解表、宣肺通窍之功效，主要用于外感风热初起，症见恶寒发热，鼻塞，喷嚏，咽干咽痛等。秦艽(Gentiana)是龙胆科龙胆属多年生草本植物，是我国历代常用的中药材，具有很高的药用价值。秦艽中含有龙胆苦苷、当药苦苷、龙胆次碱、挥发油及多糖等成分，现代药理研究发现秦艽具有抗炎、镇痛、调节免疫、保护肝损伤、抗菌、降血压、利尿消肿等作用[3-4]，广泛用于心脑血管疾病、呼吸道疾病、肝胆疾病、风湿、类风湿关节炎等疾病的治疗[4-6]。有研究者报道黄芪和秦艽中的秦艽多糖具有抗甲型流感病毒的作用，本研究通过黄芪和秦艽提取物单独和联合作用于小鼠甲型流感模型，以探讨其抗甲型流感病毒效果及机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　黄芪针剂(上海福达制药有限公司)，浓度为2 000 g/L，稀释成100 g/L后备用。秦艽(青海省海北州)，配制成浓度为0.5 g生药/mL的溶液，4 ℃冰箱保存。将上述100 g/L黄芪溶液和0.5 g生药/mL秦艽溶液以体积比为1∶1的比例混合制成黄芪和秦艽提取物。利巴韦林针剂(四川美大康药业股份有限公司)。

　　秦艽溶液制作方法：精密称取干燥的秦艽200 g，加水1 000 mL浸泡30 min，然后在电子可调电炉上煮沸，文火煎煮30 min，过滤煎煮液，药渣加水1 000 mL，同样的方法煎煮3遍，将3次的滤液混合，于40 ℃～50 ℃下常压蒸发浓缩至0.5 g生药/mL，4 ℃冰箱保存。

　　昆明种小白鼠购自湖北省医学实验动物中心，雌雄不限，体重18～22 g(动物合格证号：鄂医动字第19-007号)。鸡胚(9日龄，南京中牧股份药械厂提供)。甲型流感病毒株A/PR8/34(武汉中科院病毒所)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 血凝实验：取24孔微孔板，除第1孔加入生理盐水0.9 mL外，其余每孔加入生理盐水0.5 mL。将增毒3次的病毒尿囊液(本实验室通过鸡胚培养获得)0.1 mL加入第l孔,混匀后取0.5 mL,加入第2孔0.5 mL，依次同法稀释至第8孔，第9孔不加病毒尿囊液，作空白对照。每孔加入0.5%鸡红细胞0.25 mL，轻轻摇匀后室温放置2 h观察。

　　记录结果为1号、3号、7号、8号、10号、13号、14号、16号、19号血凝滴度在640以上，可用于甲型流感病毒感染小鼠半数致死量(LD50)滴定。

　　1.2.2 小鼠半数致死量(LD50)滴定：取小鼠56只，体重18～22 g，随机分7组，每组8只，取增毒3次的病毒尿囊液，10倍稀释，每组滴定一个病毒浓度，各组小鼠在乙醚浅麻醉下以血凝滴度为640病毒尿囊液30 μL滴鼻感染小鼠，观察14 d内死亡数，按ReedMuench法计算，结果LD50为10-2.50。

　　1.2.3 对小鼠流感病毒性肺炎的影响： 将体重为18～22 g 的小鼠随机分组，药物组于感染前1 d 开始滴鼻给药，0.05 mL/次，2次/d，连续5 d，对照组给予同容积蒸馏水滴鼻。各组在乙醚轻度麻醉下流感病毒以LD50量感染鼠肺，96 h后处死，称体重后取肺称重，计算肺指数(每100 g体重的肺质量，即肺指数=肺质量/体重×100)和肺指数抑制率[(病毒对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/病毒对照组平均肺指数×100%]。

　　1.2.4 小鼠死亡保护率和延长生命率：将小鼠随机分为病毒对照组和药物组，分别以LD50量滴鼻感染，给药组自感染病毒前1 d开始到感染后4 d，共滴鼻给药0.05 mL/次，2次/d ，病毒对照组滴鼻给予等量蒸馏水，逐日观察动物发病和记录死亡数，共观察14 d，计算死亡保护率=[(对照组死亡率-给药组死亡率)×100%]、延长生命率=[(给药组平均存活日数-对照组平均存活日数)/对照组平均存活日数×100%]。

　　1.3 统计方法

　　数据采用SPSS 13.0统计软件处理，组间进行LSDt检验和卡方检验。

　　2 结果

　　2.1 对小鼠流感病毒性肺炎的影响

　　黄芪和秦艽按1∶1体积比混合后，按每次滴鼻0.05 mL，2次/d的剂量对小鼠流感病毒性肺炎有显著治疗作用，其疗效优于病毒唑组和单独黄芪组、秦艽组(表 1)。　表1 各组小鼠流感性肺炎指标结果比较　注:与病毒对照比较,*P<0.05,**P<0.01

　　2.2 对流感小鼠的死亡保护和延长生命作用

　　与病毒对照组和单独的黄芪组、秦艽组相比，黄芪和秦艽按1∶1体积比混合后对小鼠体内感染流感病毒的死亡保护作用更加明显，能更显著的延长病鼠生命(表2)。表2 各组流感小鼠的死亡保护作用结果注：与病毒对照组比较,*P<0.05;**P<0.01

　　3 讨论

　　流感病毒是引起急性上呼吸道感染的主要病毒，并且呈周期性大流行，严重威胁着人类健康。流感病毒感染首先入侵鼻咽、口咽、喉部和扁桃体的局部黏膜和黏膜下，在这些部位复制并释放病毒颗粒和毒素。由于仅引起呼吸道局部表面感染,除腺病毒外，所产生的抗体量少，故再感染经常发生。目前临床用于抗A型流感病毒的药物有金刚烷胺(amatadine)、甲基金刚胺(rimantadine)、病毒唑(virazole)和干扰素等，前二者可引起中枢性眩晕和出现迅速耐药毒株;而低剂量口服病毒唑1.0 g/d无明显抗病毒作用，大剂量口服对无并发症流感患者退热与症状消除的作用较快，但大剂量口服毒性较大，且对B型流感无治疗作用;对流感和副流感感染者的治疗效果，目前看法不一。

　　草药自然资源丰富，品种繁多，毒副作用低，价格低廉，是较为理想的抗病毒治疗药物。通过长期的研究和探索，中医药治疗病毒性疾病已取得了很大进展，显示了中医药治疗病毒性疾病的独特优势。黄芪和秦艽都是我国使用已久的中药材，且都被验证具有抗甲型流感病毒的作用。赵文等[7]发现黄芪对于流感病毒及I型单纯疱疹病毒的感染具有显著的抑制效果。李福安等[8]利用流感病毒感染小鼠肺部模型证实秦艽对甲型流感病毒感染小鼠肺指数、肺组织形态学都有显著的保护作用。本试验结果显示将这两种药材联合使用能达到更好的抗病毒效果，黄芪和秦艽抗流感病毒的作用机制可能为:膜稳定作用，增强抵抗能力;直接的抗病毒物质和/或诱导干扰素合成、NK细胞活性，从而杀灭部分病毒，减轻对心肌细胞的损害。这表明黄芪和秦艽联合使用对病毒性感冒的病因治疗具有良好的前景。

　　目前大量的实验研究集中在药物筛选，而对药物有效成分、机制方面的研究不多，且多数研究者专注于单一药物的药效研究，很多中药之所以有显著的治疗疾病的作用是在于其中有多种具有药效作用的成分，加强药物之间的交叉研究以及多学科间的合作交流将会进一步促进中药的发展。

　　【参考文献】

　　[1]晏洪波, 梁 文.黄芪的免疫调节及抗病毒作用[J]. 华南国防医学杂志, 2008, 22 (6): 69-70.

　　[2]蔡小燕, 许艳丽, 林小军.黄芪对红斑狼疮细胞凋亡和T 淋巴细胞亚群的影响[J].实用医学杂志,2006,22(9):1 077-1 079.

　　[3]de Mello JRB,de Mello FB,Langeloh A.Preclinic toxicity of a phytoterapic containing aloe ferox,quassia amara,cynara scolymus,gentiana lutea,peumus boldus,rhamnus purshiana,solanum paniculatum and valeriana officinalis[J].Latin American Journal of pharmacy, 2009, 28(2): 183-191.

　　[4]穆祯强, 于 洋, 高 昊,等.龙胆属秦艽组植物的化学成分和药理作用研究进展[J].中国中药杂志, 2009, 34(16): 2012-2017.

　　[5]侯洁文, 姚 烁, 黄黎明,等.琴艽地上部分中龙胆总苷对大鼠胃肠活动的影响[J].中药药理与临床, 2007, 23(5): 105-107.

　　[6]章 漳, 段朝辉,丁 侃,等.长梗琴艽酮通过调节Akt和ERK1/2通路抑制人肝癌BEL7402细胞生长[J]. 中国中药杂志, 2009, 34(24): 3 277-3 280.

　　[7]赵 文, 任永风, 樊建航.新疆黄芪抗病毒作用研究[J]. 中国药学杂志, 2001, 36(1):23-25.

　　[8]李福安, 李永平, 童 丽,等.秦艽抗甲型流感病毒的药效学实验研究[J]. 世界科学技术-中医药现代化, 2007, 9(4): 41-45