雌激素及拮抗剂三苯氧胺对子宫内膜癌细胞生长的影响

　　【摘要】 目的 研究雌激素及拮抗剂三苯氧胺对子宫内膜癌细胞HEC1B生长的影响。方法 体外培养中分化子宫内膜癌细胞HEC1B，按实验目的分别加入17β雌二醇(E2，10-8M)、三苯氧胺(TAM，10-7 M)刺激24、48、72、96 h后，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色方法比较各个条件下的细胞数目。用流式细胞术方法检测加入E2、TAM后的细胞周期变化，比较各个条件下的S期细胞比率(SPF)。结果 MTT结果：E2、TAM在作用72 h和96 h后，可显著刺激HEC1B细胞生长(P<0.05)。HEC1B细胞加入E2刺激后，SPF在加药72 h和96 h均增高。TAM作用细胞后，SPF值在药物作用48 h起均高于对照组。结论 雌激素、三苯氧胺均对子宫内膜癌HEC1B细胞有促生长作用。

　　【关键词】 子宫内膜肿瘤;雌激素;三苯氧胺;细胞生长

　　The effect of estrogen and tamoxifen on the growth of endometrial carcinoma cell LI Li*,LIAO Qinping,YU Li,et al.* Department of Obstetrics and Gynecology,Ditan Hospital,Beijing 100015,China

　　【Abstract 】 Objective To investigate the effect of estrogen and tamoxifen on the growth of endometrial carcinoma cell line-HEC1B. Methods The endometrial cancer cell lineHEC1B was cultured in vitro. The cells were stimulated with 17βestrodiol(10-8M)and tamoxifen (10-7M)for 24 h,48 h,72 h,96 h respectively. The proliferation capacity of the cells was evaluated by means of mircocutrue tetrazolium assay (MTT) and the changes of cell cycle after E2 and TAM introduction were detected by flow cytometry (FCM).The cells percentage in S phase(SPF)in different conditions was compared.Results Both 17βestrodiol and tamoxifen could significantly stimulate the growth of HEC1B cell 72h and 96h after E2,TAM introduction. HEC1B cells could increase SPF 72h and 96h after E2 stimulation. The SPF of HEC1B cell 48h,72h,96h after TAM introduction was higher than that of control group.Conclusion Both estrogen and tamoxifen can stimulate the growth of HEC1B cell line.

　　【Key words】 endometrial carcinoma;estrogen;tamoxifen;cell growth

　　子宫内膜癌是女性生殖道最常见的三大恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈上升趋势，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%～30%[1]。目前普遍认为子宫内膜癌是激素依赖性肿瘤之一。其发生、发展与多种激素及其拮抗剂、受体密切相关。本实验研究雌激素及其拮抗剂三苯氧胺(TAM)对子宫内膜癌细胞生长的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 选用中分化子宫内膜癌细胞系HEC1B，由北京大学第一医院妇产科研究室传代。

　　1.2 试剂与仪器 去酚红DMEM/F12 细胞培养液(美国Hyclone 公司);DMEM/F12 细胞培养液(美国Hyclone公司);胎牛血清(FBS，美国Invitrogen公司);17β雌二醇(17βestrodiol，E2，美国Sigma公司)和TAM(美国Sigma公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT，美国Sigma公司);96孔板(COSAR公司);PBS液(自行配制);RNA酶(市售);碘化丙啶(PI，市售);流式细胞仪(美国Bectondickinson公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 细胞培养：用含5%FBS的DMEM/F12培养液，在37℃、95%空气、5%二氧化碳的条件下进行培养，传代三代以上。

　　1.3.2 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定子宫内膜癌细胞HEC1B细胞生长情况：细胞消化后以2×104/ml浓度接种入96孔板，每孔150 μl。隔日换液。用含1%活性炭处理的胎牛血清的去酚红DMEM/F12培养液继续培养24 h，将细胞分组处理：E2(10-8M)组、TAM (10-7M )组、对照组，分别刺激24、48、72、96 h。每组8个复孔。3组按相应时间用MTT法测定细胞生长情况，选择492 nm波长测定吸光值。

　　1.3.3 流式细胞术(FCM)测定细胞周期：细胞换用无酚红DMEM/F12培养液培养24 h后分别加入E2(10-8M)、TAM (10-7M)及培养液刺激24、48、72、96 h。3组细胞用胰酶/EDTA消化后，制成活的单细胞悬液，室温1 000 r/min离心5 min，吸去上清。加入0.01 mmol/L PBS洗两遍，镜下计数每组细胞总数均在(2～5)×106个。离心去除PBS，加入预冷的70%的乙醇固定，4℃过夜。14 000 g短时离心沉淀细胞，弃去固定液， PBS洗1次。离心去除PBS，加入RNA酶(100 μg/ml)，室温30 min酶切RNA。PI溶液(终浓度为100 μg/ml)1 ml搅拌，4℃避光20～30 min。流式细胞仪检测：以激发波长488 nm测定。采用S 期细胞比率(SPF)作为分析指标：SPF(%)=[S/(G0G1+S+G2M)]×100%。

　　1.4 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示，组间差异采用One Way ANOVA进行处理，FCM结果采用描述性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MTT法测定药物刺激不同时限HEC1B细胞生长情况

　　2.1.1 E2作用HE1B细胞不同时间吸光值比较：加入E2后24 h和48 h，E2组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)，加药后72 h和96 h，E2显著刺激HEC1B细胞生长(P<0.05)。见表1。表1 E2作用不同时间的吸光值比较

　　2.1.2 TAM作用HEC1B细胞不同时间吸光值比较：加入TAM后24 h和48 h，TAM组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)，加药后72 h和96 h，明显刺激HEC1B细胞生长，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。表2 TAM作用不同时间吸光值比较

　　2.2 应用流式细胞仪分析不同药物对细胞周期的影响 HEC1B细胞加入E2刺激后，S期细胞比率在加药72 h和96 h逐渐高于对照组，细胞增殖活跃。TAM作用细胞后，SPF值在24 h无明显增高，48 h开始有升高趋势，SPF在加药72 h和96 h均明显高于对照组。见表3。表3 3组药物刺激不同时间SPF值比较

　　3 讨论

　　3.1 雌激素对子宫内膜癌细胞的影响 70%～80%子宫内膜癌为激素依赖型肿瘤，其发生与子宫内膜长期接受雌激素的频繁刺激而缺乏孕酮拮抗有关。多数子宫内膜癌患者具有高雌激素状态，证实了肿瘤对体内高雌激素的依赖性[2]。本实验结果显示，雌激素可明显促进子宫内膜癌HEC1B细胞的生长，能使S期细胞比例明显升高，促进细胞的分裂、增殖，减少细胞凋亡。子宫局部血流内高雌激素血症是引起子宫内膜增生的关键因素，认为高浓度的E2水平对二倍体内膜癌细胞的生长有促进作用。国外学者对子宫内膜腺癌细胞系HEC1A、ECC1和PRAB36进行研究，发现17β雌二醇具有促进子宫内膜癌细胞生长作用，其作用与不同的雌激素受体亚型有关[3,4]。雌激素的作用途径[5]主要是通过与细胞内特异性受体ERα、ERβ在细胞核内结合，激活转录，使细胞核内DNA和蛋白质合成增加，导致子宫内膜上皮细胞增生。或是通过细胞膜的非基因转录，发生快速效应，其具体机制尚不明确。张丽丽等[6]研究认为，17β雌二醇可以通过细胞膜受体对子宫内膜癌Ishikawa细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的快速激活效应，引起细胞生物学变化。

　　3.2 TAM对子宫内膜癌细胞的影响 TAM(又名他莫西芬，Tamoxifen)，是一种含三苯乙烯的非甾体抗雌激素药物，结构上类似己烯雌酚，能与胞浆内的雌激素受体(ER)结合为复合物进入细胞核，使游离ER数目减少，从而对内源性雌激素具有竞争性抑制作用，同时它又具有弱雌激素的作用。TAM于1967年问世，1971年首次用于临床，30年来被广泛应用于乳腺癌的辅助内分泌治疗。它可使对侧乳腺癌的发生率降低50%，并在一定程度上改善患者的预后，减少复发。在TAM用于乳腺癌辅助治疗方面取得肯定疗效的同时，人们发现TAM可以诱发子宫内膜癌。国内外学者分别报道了TAM诱发子宫内膜癌的危险性，发生子宫内膜癌的危险度随用药时间增长而增加，累积剂量也与子宫内膜癌危险相关[7]。

　　本研究显示，TAM可明显促进子宫内膜癌HEC1B细胞的生长，这种促生长作用在药物刺激72 h开始显著。并且可以影响细胞周期，能使S 期细胞比率明显升高，促进细胞的分裂、增殖。TAM的雌激素样作用和抗雌激素作用有器官特异性，不同靶组织对TAM效应不一致。在子宫内膜癌和乳腺癌的细胞系研究中发现，TAM抑制乳腺癌MCF7细胞系的生长，但是刺激人子宫内膜癌Ishikawa细胞系的生长，呈现相反的作用。TAM的部分代谢产物及同分异构体均具有不同程度的雌激素样作用，这可能是诱发子宫内膜癌的根据所在。

　　【参考文献】

　　1 Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002.CA Cancer J Clin，2005，55：74108.

　　2 郜玲，王凤香.子宫内膜癌患者的性激素表现.标记免疫分析与临床，2003，10：127128.

　　3 CastroRivera E，Safe S.17 betaestradioland 4hydroxytamoxifen-induced transactivation in breast， endometrial and liver cancer cells is dependent on ERsubtype，cell and promoter context.J Steroid Biochem Mol Biol，2003，84：2331.

　　4 Gielen SC， Hanekamp EE， HanifiMoghaddam P， et al. Growth regulation and transcriptional activities of estrogen and progesterone in human endometrial cancer cells.Int J Gynecol Cancer，2006，16：110120.

　　5 路泽军，宋琪，罗锋.激素在子宫内膜癌发生中的作用.华西医学，2008，23：671672.

　　6 张丽丽，李小平，王建六，等.雌激素通过子宫内膜癌细胞膜受体激活丝裂原活化蛋白激酶通路快速效应的初步研究.中华妇产科杂志，2008，43：615618.

　　7 Liesbeth B，Maureen LR，Maarten PW，et al.Risk and prognosis of endometrial cancer after tamoxifen for breast cancer.The Lancet，2000，356：881887.