尿脱落细胞CK20检测对膀胱癌诊断的意义

　　【摘要】 目的 研究膀胱癌患者尿脱落细胞中细胞角蛋白20(CK20)的表达探讨及其对膀胱癌的诊断意义。方法 利用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测47例膀胱癌患者，19例非肿瘤患者及9例健康志愿者尿脱落细胞CK20 mRNA的表达情况。结果 47例膀胱癌患者中，尿脱落细胞CK20阳性表达41例，阳性率87.2%;对照组28例中，阳性表达2例，阳性率7.1%。RTPCR方法检测膀胱癌尿脱落细胞中CK20敏感性为87.2%，特异性为92.9%。PTa～T1期及PT2～T4期膀胱癌，其阳性率分别为85.7%(18/21)和88.5%(23/26)，两者差异无统计学意义(P>0.05)。在G1、G2及G3级膀胱癌，其阳性率分别为85.7%(12/14)、85.7%(18/21)及91.7%(11/12)，各级间差异无统计学意义(P>0.05)。CK20的表达同膀胱癌的分期、分级无关。结论 CK20是一种较为理想的膀胱肿瘤标记物，利用RTPCR检测尿脱落细胞中CK20可用于膀胱癌的诊断。

　　【关键词】 膀胱癌;尿脱落细胞;细胞角蛋白20;逆转录聚合酶链反应;诊断

　　The diagnostic significance of detecting CK20 in exfoliated urothelial cells for bladder cancer BI Changfu,ZHANG Kerong,DONG Hao,et al. Department of Urology, Shanhaiguan People’s Hospital, Hebei, Qinghuangdao 066200,China

　　【Abstract】 Objective To investigate the expression of cytokeratin 20 in exfoliated urothelial cells of patients with bladder cancer and to evaluate its diagnostic significance.Methods The reverse transcriptasepolymerase chain reaction(RTPCR) was used to determine the expression of CK20 in exfoliated urothelial cells of 47 patients with bladder cancer, 19 patients with nonmalignant urologic disease and 9 healthy subjects.Results The positive expression of CK20 was found in 41 patients with bladder cancer, however,,only 2 positive cases were detected in control group. The sensitivity and specificity of the CK20 mRNA assay for bladder cancer was 87.2% and 92.9% respectively. The positive rate of CK20 in PTa～T1 and PT2～T4 patients was 85.7%(18/21) and 88.5%(23/26) respectively. The positive rate of CK20 in G1,G2 and G3 patients was 85.7%(12/14),85.7%(18/21) and 91.7%(11/12), respectively. The CK20 expression in exfoliated urothelial cells was not related to the tumor grades and stages. Conclusion CK20 may serve as a appropriate tumor marker for bladder cancer. The detection of CK20 mRNA in exfoliated urothelial cells by RTPCR can be used in the diagnosis of bladder cancer.

　　【Key words】 bladder cancer; exfoliated urothelial cells;cytokeratin 20;RTPCR;diagnosis

　　细胞角蛋白(cytokeratin,CK)是分布于上皮细胞的中间纤维丝，它包括至少20个成员。CK20是细胞角蛋白家族中的一员，由Moll等于1990年分离并鉴定[1]。CK20具有很强的组织特异性，在膀胱癌组织呈异常高表达[2]。由于膀胱移行细胞癌在生长过程中肿瘤细胞很容易脱落到尿液中，我们采用RTPCR方法检测膀胱癌患者尿脱落细胞中CK20的表达，探讨其在膀胱癌诊断中的意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 经活检病理确诊的膀胱移行细胞癌患者47例，其中男31例，女16例;年龄36～77岁，平均年龄57.4岁。按WHO组织分级：G1 14例，G2 21例，G3 12例。按TNM标准分期PTa～T1 21例，PT2～T4 26例。对照组为9例健康志愿者和19例泌尿系非肿瘤患者(前列腺增生9例，下尿路结石4例，下尿路感染6例)，其中男20例，女8例;年龄32～74岁，平均年龄55.6岁。

　　1.2 试剂 总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)，一步法RTPCR试剂盒(TaKaRa大连有限公司)。CK20上游引物：5’CAGACACACGGTGAACTATGG3’，下游引物：5’GATCAGCTTCCACTGTTAGACG3’，扩增产物长度370 bp。内参照GAPDH上游引物：5’GGATTTGGTCGTATTGGG3’，下游引物：5’GGAAGATGGTGATGGGATT3’，扩增产物长度205 bp。上述所有引物均由上海英俊生物公司合成。

　　1.3 方法 收集研究对象的新鲜晨尿100 ml，立即经4℃，3 000 r/min，离心10 min，沉淀脱落细胞。冷PBS洗涤尿沉渣2次，收集脱落细胞于1.5 ml的Eppendorf管中，按总RNA提取试剂盒按说明书提取尿脱落细胞的总RNA。用紫外分光光度计(日本岛津Uv2201型)测定总RNA浓度和纯度，重复测定3次，OD260和OD280之比值1.8～2.0，计算样品总RNA浓度。按说明书进行一步法RTPCR，总反应体系50 μl。RT反应，50℃ 30 min;RTase灭活，94℃ 2 min;PCR反应，94℃ 30 s→58℃ 30 s→72℃ 1 min，共30个循环;末轮延伸，72℃ 5 min。RTPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶(含EB 0.5 μg/ml)电泳，凝胶成像仪拍照。

　　1.4 结果判断 出现370 bp和205 bp内参电泳带者为CK20阳性，仅出现一条205 bp内参电泳带者为CK20阴性。

　　1.5 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计数资料采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 尿脱落细胞CK20 RTPCR检测结果 RTPCR检测结果显示47例膀胱癌患者中，尿脱落细胞CK20 mRNA阳性41例，阳性率87.2%。对照组28例中，CK20 mRNA阳性2例(均为下尿路感染患者)，阳性率7.1%。2组比较差异有统计学意义(P<0.01)。本组资料显示尿脱落细胞CK20 mRNA用于膀胱癌诊断的敏感性为87.2%，特异性为92.9%;阳性预测值为95.3%，阴性预测值为83.9%。

　　2.2 尿脱落细胞CK20与膀胱癌病理分期、分级的关系 尿脱落细胞CK20 mRNA的表达阳性率PTa～T1期85.7%(18/21)，PT2～T4期88.5%(23/26)，差异无统计学意义(P>0.05)。按病理分级，尿脱落细胞CK20表达阳性率G1 85.7%(12/14)、G2 85.7%(18/21)、G3 91.7%(11/12)，差异无统计学意义(P>0.05)。

　　3 讨论

　　膀胱镜检查和尿脱落细胞学检查是目前筛选和诊断膀胱癌的基本方法。然而膀胱镜检查具有创伤性，尿脱落细胞学检查的敏感性较低，这是这两种传统方法的不足之处。因此，寻找一种非创伤性的、敏感性高的检查方法对膀胱癌早期发现是一个重要的课题。CK20最初由Moll等于1990年分离鉴定，并采用免疫组织化学方法对CK20在各种不同组织中的分布规律进行了详细的研究，为CK20的广泛应用奠定了基础[3]。CK20有严格的上皮特异性分布，它主要分布在胃肠黏膜上皮细胞、尿路黏膜表层细胞和表皮的Merkel细胞，且特异性地存在于这些细胞来源的肿瘤内[4]。

　　由于膀胱移行细胞癌的组织学特点及特殊生长方式，绝大多数膀胱肿瘤标志物都可以出现于尿液中。而CK20在膀胱癌的特异性高表达，使得通过检测尿脱落细胞中CK20表达来筛选诊断膀胱癌成为可能。RTPCR对靶基因的检测具有敏感性高，易操作的特点，已广泛应用于实验及临床研究。Klein等[5]报道用RTPCR方法可以检测出尿中存在于106个正常细胞中的1个肿瘤细胞，用于检测CK20的敏感性为91%，特异性67%。本研究中，我们采用RTPCR方法检测膀胱癌患者尿中CK20 mRNA的表达，发现其敏感性为87.2%，特异性为92.9%，明显优于常规尿脱落细胞形态学检查方法。47例膀胱癌患者中，尿脱落细胞CK20的表达阴性6例(12.8%)，可能与自然脱落的细胞易崩解导致RNA降解破坏及单个或少数肿瘤细胞存在异质性不表达CK20 mRNA等情况有关。对照组2例阳性患者均为膀胱慢性炎症，可能与炎症导致上皮的不典型增生及异常脱落有关。另外，我们还应该注意由肾盂癌及输尿管癌等其他尿路上皮癌所引起的假阳性结果[6]。

　　目前CK20的表达与膀胱癌的分级、分期的关系尚未确定，多数研究认为CK20的表达与肿瘤分级、分期无关，我们的研究支持这一观点。但Rotem等[7]报道CK20的表达与肿瘤分级、分期密切相关。本研究表明用RTPCR的方法检测尿脱落细胞中CK20 mRNA的表达，对膀胱癌诊断的敏感性高，具有潜在的临床应用价值。

　　【参考文献】

　　1 Moll R, Schiller DL,Franke WW.Identification of protein IT of the intestinal cytoskeleton as a novel type Ⅰ cytokeratin with unusual properties and expression patterns.J Cell Biol,1990,111:567580.

　　2 王兆亮,朱建善,刘强,等.细胞角蛋白20在51例膀胱尿路上皮癌中的表达.上海医学,2005, 28:487489.

　　3 倪晓辰，冯永路，马树，等.IL18基因转染膀胱癌细胞的建立及其仰癌作用研究.河北医药，2008，30：929931.

　　4 Moll R, Lowe A, Laufer J, et al. Cytokeratin 20 in human carcinomas:A new histodiagnostic marker detected by monoclonal antibodies.Am J Pathol,1992,140:427447.

　　5 Klein A, Zemer R, Buchumensky V, et al. Expression of cytokeratin 20 in urinary cytology of patients with bladder carcinoma.Cancer,1998,82:349354.

　　6 沈海波, 叶敏.膀胱癌患者尿脱落细胞中细胞角蛋白20的表达及临床意义.中华泌尿外科杂志,2002,23:291293.

　　7 Rotem D, Cassel A, Lindenfeld N, et al. Urinary cytokeratin 20 as a marker for transitional cell carcinoma.Eur Urol, 2000,37:601604.