大孔吸附树脂分离纯化青番茄中的番茄苷

　　【摘要】 目的 研究探讨大孔吸附树脂分离纯化青番茄中番茄苷的工艺。方法 采用HPLC-MS/MS检测青番茄中的番茄苷,以番茄苷浓度为指标,考察大孔吸附树脂分离纯化番茄苷的工艺。结果 HPD-100A大孔吸附树脂最佳工艺条件为：柱体积510 mL,上样体积为6 BV,先用蒸馏水洗脱,再用95%乙醇洗脱,洗脱体积共为6 BV。番茄苷粗品经上述工艺纯化后,含量达到26.48%。结论 HPD-100A大孔吸附树脂对番茄苷有较好的吸附分离性能,是分离纯化番茄苷的最佳大孔吸附树脂。

　　【关键词】 番茄苷;大孔吸附树脂;分离纯化;高效液相色谱串联质谱法

　　Separation and Purification of Tomatine in Green Tomatoes with Macroporous Adsorption Resin XU Qiao-xia1, DU Ping2, SU Ye-ping1, et al (1.Pharmacy College of Shihezi University, Shihezi 832000, China;2.Institute of Xinjiang Chalkis Tomato Co. LTD, Urumqi 830088, China)

　　Abstract：Objective To improve the content of tomatine in green tomatoes by separation and purification of tomatine with macroporous adsorption resin. Method HPLC-MS/MS methods were established to determine the tomatine in green tomatoes. With the concentration of tomatine as the main index, the technologies of separation and purification of tomatine with macroporous adsorption resin were studied. Result The optimal technologies of HPD-100A macroporous absorption resin were as follows：pillar volume was 510 mL, the volume of sample added was 6 BV. The column was washed by distilled water and then 95% ethanol, the elution volume was 6 BV. The content of tomatine was 26.48% in crude tomatine after purification with above technologies. Conclusion The adsorption and separation capability of HPD-100A macroporous absorption resin was good, and it was the optimal resin.

　　Key words：tomatine;macroporous adsorption resin;separation and purification;HPLC-MS/MS

　　番茄苷(tomatine)是存在于茄子、马铃薯和番茄等茄科(Solanaceae)植物中的一种含有D-木糖、D-半乳糖及两分子葡萄糖的甾体类生物碱糖苷,糖链连接于苷元的“3-”位,属于螺旋甾碱烷类生物碱糖苷大类中的番茄碱类[1]。番茄苷在番茄植株中的含量最高,是番茄根茎、叶、青果中产生的次生代谢物,在叶内的含量高于根和茎。番茄苷含量随果实成熟变红逐渐降低[2]。其具有抗菌、抗病毒、抗虫、抗肿瘤等广泛的药理作用,同时也存在对胃肠黏膜的刺激、造成小鼠胚胎畸形或颅面畸形等不良反应[3-5]。

　　目前国内企业生产加工番茄制品所收购的原料中,青番茄占8%左右,但通常被作为废料丢弃,不仅污染环境,而且浪费资源[6]。本试验采用大孔吸附树脂分离纯化番茄苷,显著提高了其含量,并用HPLC-MS/MS对番茄苷进行定量分析。若能对青番茄中的番茄苷形成工业化生产,开发出科技含量及附加值高的产品,将会变废为宝,对国内番茄产业效益的提高具有一定的经济价值。

　　1 仪器与试药

　　Agilent1200RRLC-Agilent6410串联三重四级杆质谱仪, 0.20 ?m四氟一次性过滤头(德国Dr),电子天平(SartoriusBP211D0.01 mg),RE-52旋转蒸发仪(上海安亭电子仪器厂),PHILIPS打浆机,电热恒温水浴锅(DZKW型,北京永光明医疗仪器厂),数显电热鼓风干燥箱(HN101型,南通泸南科学仪器有限公司),超声波清洗仪(KQ5200DB型,昆山市超声仪器有限公司)。

　　新鲜青番茄：青熟期,全果为翠绿色,部分果顶为白色。番茄苷对照品(上海化成工业发展有限公司,批号6-15-9)。甲醇(色谱纯,美国TENDA)。HPD-100A、HPD-400A、HPD-80A大孔吸附树脂。

　　2 方法

　　2.1 番茄苷的含量测定

　　2.1.1 分析条件 流动相为CH3OH∶10 mmol/L醋酸胺水溶液(含0.1%HCOOH)=50∶50(V1∶V2),离子扫描(SIM),ESI(+), XDB-C18柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm),柱温40 ℃,进样量3 μL,流速0.2 mL/min。干燥气温度350 ℃,干燥气流量9 L/min,雾化气压力40 psi(1 psi=6.895 kPa),毛细管电压+4 000 V,源内碎裂电压135 V。

　　2.1.2 番茄苷对照品溶液的配制 精密称取10.10 mg番茄苷对照品,用甲醇溶解,定容在100 mL的容量瓶中,制得番茄苷对照品储备液。

　　2.1.3 标准曲线的建立 将番茄苷对照品储备液用甲醇稀释为0.050 5、0.101 0、0.202 0、0.303 0、0.505 0 g/mL的溶液,每一浓度进3针测定。以峰面积为纵坐标,对照品浓度为横坐标,得线性方程Y=1 249.8X-0.673 3,r=0.999 8,线性范围为0.050 5～0.505 0 g/mL。HPLC-MS/MS图见图1。

　　A B

　　注：A.番茄苷对照品;B.纯化后番茄苷样品

　　图1 番茄苷HPLC-MS/MS图谱

　　2.1.4 稳定性试验 取浓度为0.202 0 g/mL对照品溶液,分别在0、2、4、8、16、24 h不同时间点进行测定,考察峰面积的一致性,平均峰面积为251.8,RSD=0.10%。

　　2.1.5 精密度试验 取浓度为0.202 0 g/mL的对照品溶液,做日内和每隔1日的日间精密度试验,各进样6次,每次进3针,计算平均峰面积,测定峰面积与出峰时间比值,计算精密度,日内RSD=0.12%,日间RSD=0.81%。

　　2.1.6 重复性试验 取浓度为0.202 0 g/mL的对照品溶液5份,每一份进3针,考察峰面积的一致性,平均峰面积为251.7, RSD=0.31%。

　　2.1.7 加样回收率试验 取浓度为0.100 0 g/mL的番茄苷样品溶液6份,各1 mL,精密测定,分别准确加入0.050 5、0.101 0、0.151 5 g/mL对照品溶液,每一浓度的对照品溶液吸取2次,各1 mL,依次加入6份样品溶液中,测定,计算回收率,结果番茄苷平均回收率为99.83%(n=6),RSD=1.33%。

　　2.2 番茄苷粗品的制备

　　青番茄打浆,用无水乙醇以1∶3(g/mL)的料液比超声提取30 min,过滤,再将滤渣以1∶1料液比超声提取20 min,过滤,合并过滤液,滤液浓缩至无醇味。用5%NaOH调浓缩液的pH大于8,静置过夜,出现沉淀。离心,沉淀用丙酮、氯仿各萃取3次,用甲醇溶解沉淀,将不溶物过滤弃去,HPLC-MS/MS测定滤液中番茄苷浓度,滤液蒸干得到番茄苷粗品,称量,计算粗品中番茄苷的含量。

　　2.3 番茄苷粗品的分离纯化工艺研究

　　2.3.1 大孔吸附树脂的选择 用20%的乙醇溶解番茄苷粗品,其中番茄苷的浓度为60 g/mL,分别上HPD-400A、HPD-100A、HPD-80A大孔吸附树脂,树脂湿体积均为510 mL,上样流速为6 mL/min,每100 mL收集1份,HPLC-MS/MS检测每一份中番茄苷的浓度,考察泄漏点,用Origin75绘图软件绘制泄漏曲线,计算番茄苷的吸附量。上样后先用蒸馏水洗脱,再用95%乙醇洗脱,直到番茄苷洗脱浓度约为0时停止洗脱。合并乙醇洗脱液,HPLC-MS/MS检测其中番茄苷的浓度,计算解吸率[7]。将乙醇洗脱液蒸干,称量,用甲醇溶解,HPLC-MS/MS检测其中的番茄苷浓度,计算洗脱物中番茄苷含量。番茄苷吸附量及解吸率分别按下式计算。

　　番茄苷吸附量(mg/mL)=被树脂吸附的番茄苷总量(mg)/湿柱体积(mL)

　　番茄苷解吸率(%)=洗脱物中番茄苷量(mg)/上柱番茄苷量(mg)×100%

　　2.3.2 洗脱剂的选择 各以510 mL处理好的湿树脂装选择出的适宜的大孔吸附树脂柱,按泄漏曲线中得出的上样体积上样后,以18 mL/min流速,用大量蒸馏水洗脱,5%苯酚-硫酸法检测糖,当检测不出糖时停止。再用95%乙醇、甲醇、乙酸乙酯-95%乙醇(V1∶V2=1∶9),流速5 mL/min,分别洗脱树脂柱。分别接样,每100 mL收集1份,HPLC-MS/MS检测番茄苷浓度,至检测不出番茄苷为止,绘制各自的洗脱曲线。分别合并3种洗脱剂的洗脱液, HPLC- MS/MS检测其中番茄苷的浓度,计算各自的解吸率。分别蒸干洗脱剂,称量洗脱物,用甲醇溶解洗脱物,HPLC-MS/MS检测其中番茄苷的浓度,计算洗脱物中番茄苷含量[8]。

　　3 结果与讨论

　　3.1 番茄苷的HPLC-MS/MS分析

　　番茄苷的分子式为C50H83NO21,相对分子量为1 033,在HPLC- MS/MS离子扫描中,选择母离子为1 034.6,tr=4.38 min。从方法学考察可以看出,HPLC-MS/MS对于番茄苷的定量测定是可行的。因为保留时间短,因此,在大孔吸附树脂型号的选择、番茄苷分离纯化工艺中,上样体积的考察、洗脱剂的选择及洗脱体积的确定等,HPLC-MS/MS都可以实现快速检测[9]。

　　3.2 番茄苷粗品制备方法的选择

　　利用番茄苷溶于乙醇、易溶于甲醇但不溶于水的特性,由于甲醇对视神经有损害,所以,选择无水乙醇提取青番茄中的番茄苷。番茄苷显碱性,在5%NaOH溶液中沉淀析出,番茄苷不溶于丙酮,利用丙酮脱去沉淀中的水。番茄苷不溶于氯仿,利用氯仿除去番茄苷沉淀中的叶绿素和部分脂溶性杂质。用甲醇将番茄苷溶解,不溶物弃去,HPLC-MS/MS测定甲醇溶液中番茄苷的浓度,蒸干甲醇,称量番茄苷粗品,计算其中番茄苷的含量为12.73%。青番茄资源丰富,并且此工艺中所使用的溶剂乙醇、丙酮、氯仿、甲醇可以回收利用,所以实现工业化生产有一定的可行性。

　　3.3 番茄苷粗品分离纯化工艺的确定

　　3.3.1 大孔吸附树脂的确定 以检测到所接样中番茄苷的浓度为上样浓度的1/10时为泄漏点,由图2可知,HPD-400A树脂番茄苷的泄漏点为5 BV,HPD-100A为6.5 BV,HPD-80A为4.5 BV。由表1可知,HPD-100A树脂分离纯化番茄苷效果较好,番茄苷吸附量最高,这是因为番茄苷为弱极性物质,在弱极性柱上更容易吸附,同时可能因为比表面积较大的原因,也较容易洗脱,洗脱物中番茄苷含量最高,故选择HPD-100A树脂分离纯化番茄苷较为合适[10]。表1 3种大孔吸附树脂对番茄苷吸附分离性能的比较

　　3.3.2 上样体积的确定 从图2中HPD-100A树脂的泄漏曲线可知,当上样体积为6 BV时番茄苷的浓度为0,继续增加上样体积,树脂达到吸附饱和,当上样到6.5 BV时,所接样中番茄苷浓度为6 ?g/mL,番茄苷泄漏,因此上样体积确定为6 BV。

　　3.3.3 洗脱剂的确定 番茄苷粗品中含有大量的水溶性杂质如色素、可溶性糖等,因此,样品上柱后先用3 BV的水洗脱,可除去极性较大的色素和糖,再用有机溶剂洗脱番茄苷。由图3可知,在95%乙醇洗脱体积为1 BV时,番茄苷的浓度为178 ?g/mL,此后在同一洗脱体积接样所测得的番茄苷浓度较甲醇和乙酸乙酯-95%乙醇(V1∶V2=1∶9)洗脱液均高。同时由表2可知,乙醇洗脱液的解吸率和洗脱物中番茄苷含量均较其他2种洗脱液高。因此,选择95%乙醇作为番茄苷的洗脱剂是可取的[11-13]。表2 3种洗脱剂的洗脱能力比较

　　3.3.4 洗脱体积的确定 从图3中95%乙醇的洗脱曲线可知,当洗脱剂的体积为3 BV时,番茄苷的洗脱浓度约为0,因此,洗脱体积确定为3 BV。

　　4 结论

　　HPD-100A大孔吸附树脂对番茄苷具有较好的吸附和解吸性能,用其纯化番茄苷粗品是可行的。HPD-100A大孔吸附树脂分离纯化番茄苷的最佳条件为：上样体积为6 BV,先用3 BV的蒸馏水除杂,然后用3 BV的95%乙醇洗脱,洗脱体积共为6 BV。HPLC- MS/MS在大孔吸附树脂分离纯化番茄苷的工艺研究中起到了快速准确检测的作用。

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