大肠癌SELDITOFMS蛋白质组图谱的分析

　　【摘要】 　　目的: 筛选并建立大肠癌血清蛋白质组图谱的诊断模型并探究其临床价值。方法: 将102例血清标本(大肠癌53例，正常对照49例)随机分成训练组75例，测试组27例。用CM10蛋白芯片及SELDITOFMS技术对训练组75例血清标本(大肠癌37例，正常对照38例)进行蛋白质组图谱检测，经留一法交叉验证后建立诊断模型，并对测试组27例未知的血清进行血清蛋白质谱测定，盲法验证该模型。结果: 通过ZUCI蛋白芯片数据分析系统软件包运算，用6个质荷比峰(3 951.147 3、4 364.486 5、5 926.628 6、8 103.635 6、8 964.429 9、11 709.016 8 m/z)建立了大肠癌蛋白质组图谱诊断模型，经过交叉验证其准确度96.00%，灵敏度94.59%，特异度97.37%，阳性预测值97.22%。经盲法验证该方法的检出率为81.25%,排除率为100%。结论: 本组建立的诊断模型可以有效区分大肠癌和非癌正常人，为大肠癌的诊断与筛查提供了一条崭新途径。

　　【关键词】 大肠癌 SELDI TOF MS 诊断模型 蛋白质组学

　　Analysis of protein patterns in serum from patients with colorectal cancer by SELDITOFMS

　　ZHANG Yuan, HUANG Yanchun, ZHANG Qiong, et al

　　(Department of Clinical Laboratory, Affiliated Tumor Hospital, Xinjiang Medical University,Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective： To analyze the alterations of serum protein patterns from patients with colorectal cancer (CRC) by SELDITOFMS (surfaceenhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry), screen and build diagnosis model of CRC and investigate its clinical value. Methods： One hundred and two serum samples (53 CRC. patients and 49 healthy individuals) were randomly divided into training set (n=75, 37 CRC. patients and 38 healthy individuals) and test set (n=27). SELDITOFMS and CM10 protein chip were used to detect the serum protein patterns of training set. The data was analyzed and the diagnostic model was established by using ZUCIprotein chip data analyze system software package. The diagnostic model was evaluated and validated by leave one cross validation. The classifier was then challenged with the test set. Results： A diagnostic model consisting of six protein peaks(3 951.147 3, 4 364.486 5, 5 926.628 6, 8 103.635 6, 8 964.429 9, 11 709.016 8 m/z) could do the best in the diagnosis between colorectal cancer and controls. Its accuracy was 96.00%, sensitivity was 94.59%, specificity was 97.37% and positive value was 97.22%. By blind examination in test set, the corresponding accuracy was 81.25%(13/16), the corresponding sensitivity was 100%(11/11). Conclusion： The diagnostic model formed by six protein peaks can do the best in discriminating colorectal cancer from controls. It provides a new approach for diagnosing and screening colorectal cancer.

　　Key words: colorectal cancer; SELDITOFMS; diagnostic model; proteomics

　　大肠癌在世界范围内是第三大常见恶性肿瘤，近年来，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，其生存率直接与诊断时疾病的严重程度有关，目前我国大肠癌就诊病人中绝大多数已为中晚期，为此，寻找大肠癌的特异性早期诊断方法是目前临床期待解决的问题。本研究利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/inionation,SELDITOFMS)技术检测大肠癌患者与正常人的血清蛋白质谱，筛选大肠癌患者血清的差异蛋白，建立诊断模型，并通过盲法的验证，为大肠癌的早期诊断提供一种新的技术和方法，并为进一步发现新的肿瘤标志物打下基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1研究对象采集2008年1～8月我院经手术病理诊断确诊为大肠癌的53例汉族患者(结肠癌23例，直肠癌30例)未治疗前血清标本，其中男性28例,女性25例,年龄33～82岁，中位年龄60岁。同期采集年龄、性别相匹配的肝功能、肾功能、便常规均正常、便潜血阴性的49例汉族体检正常者血清标本。将102例标本随机分成训练组75例(大肠癌37例，正常对照38例)，测试组27例(大肠癌16例，正常对照11例)。

　　1.1.2实验仪器与试剂Protein Chip Biology System (PBS IIC) 质谱仪、弱阳离子交换蛋白芯片(CM10 蛋白芯片，Cip hergen Biosystems 公司，US)。尿素(Urea)、乙腈(CAN)、3[3(胆酰胺基丙酸)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS)、50%乙腈和0.5%三氟乙酸饱和溶液(SPA)。三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris2Hcl)、二硫苏糖醇(DDT)等均购自美国Sigma公司。96孔细胞培养板购自美国BD公司。

　　1.2方法

　　1.2.1样品收集准备空腹静脉血采集后4℃静置，离心分离血清，放入-80℃冰箱保存。血清样本冰浴中解冻,10 000 r/min，4℃离心5 min，除去血清中的不溶物。取5 μl血清加10 μl U9缓冲液(9 mol/L Urea，2% CHAPS,1% DTT)稀释混匀,振荡器600 r/min 4℃振荡30 min。然后向15 μl稀释样品中加185 μl醋酸钠缓冲液(50 mmol/L NaAC,PH4.0)，振荡器上混匀。

　　1.2.2芯片预处理取醋酸钠缓冲液200 μl/孔平衡芯片2次,每次5 min;取稀释后的血清样品100 μl/孔加至芯片上,4℃振荡1 h;取醋酸钠缓冲液200 μl/孔洗脱芯片3次,每次5 min;再以去离子水快速冲洗芯片2次;待芯片自然晾干后，点加能量吸收剂SPA(含饱和芥子酸溶于50%乙腈和0.5%三氟乙酸)1 μl/孔2次。

　　1.2.3芯片检测将芯片置入蛋白芯片阅读机中,用加有Allinone标准蛋白质的NP20芯片校正仪器至0.1%范围内。芯片阅读仪参数设置如下:激光强度190,检测灵敏度8,收集数据的最高分子量50 000，优化相对分子质量范围2 000～20 000,信号收集位置从20～80，每个样本取144个点。Ciphergen ProteinChip3.0软件收集数据并输出。

　　1.2.4数据收集与处理采用ZUCI Protein Chip Data Analyze System软件包分析所得到的数据。用支持向量机方法建立蛋白质指纹图诊断模型，用留一法交叉验证作为评估模型判别效果的方法。特征向量的选取采用统计过滤结合模型依赖性筛选的方法。对每个荷质比峰作Wilconxon秩和检验，检验水准α=0.01，选出P值最小的几个峰进一步分析。将几个峰的任意组合用于支持向量机模型的输入，用留一法评估模型的预测效果，选出建立支持向量机模型预测的约登指数最高的组合作为最终的候选标志物。

　　2结果

　　2.1大肠癌血清蛋白质组图谱诊断模型的建立检测训练组37例大肠癌患者与38例正常对照血清标本，在相对分子质量2 000～20 000范围内，共检测到215个蛋白质荷比峰，其中103个差异有统计学意义(P<0.01)。通过软件包运算，判别分析选出其中6个质荷比峰(3 951.147 3、4 364.486 5、5 926.628 6、8 103.635 6、8 964.429 9、11 709.016 8 m/z)建立了大肠癌血清蛋白质组图谱的诊断模型(表1);其中质荷比为5 926.628 6的蛋白峰在大肠癌组中高表达，在正常对照组中低表达(图1)。

　　表1组合模型的6个差异蛋白峰在大肠癌组和正常对照组中的相对强度的比较(略)

　　2.2留一法交叉验证诊断模型判别效果该诊断模型对37例大肠癌患者组中35例判定正确，2例误判;38例正常对照组中37例判定正确，1例误判，其准确度为96.00%，灵敏度为94.59%，特异度为97.37%，阳性预测值为97.22%。

　　2.3盲法分析结果对测试组27例未知的血清进行血清蛋白质谱测定，并将测定数据导入已建立的模型中进行判定，结果显示，16例大肠癌中有13例被准确判定，11例正常人中有11例被准确判定。该方法的检出率为81.25%(13/16),排除率为100%(11/11)。

　　图1大肠癌组和正常对照组在质荷比为5 926.628 6D处蛋白质含量的差异(略)

　　3讨论

　　大肠癌是一种多基因、多步骤的复杂性疾病，其发生发展是一个包含了多个基因突变的分子事件过程。而基因异常的表现形式也会发生蛋白质层面的改变，由于人血清是一个蛋白质相当丰富并不断变化的系统，单一的血清肿瘤标记物难以真正追溯到相关的细胞组织，而发现一组与特定组织癌变相关的血清蛋白质则是更有效的途径，对蛋白质和蛋白质组学进行研究可以直接获取疾病的特征性标志。近几年兴起的SELDITOFMS技术为蛋白质组学研究提供了一个理想平台，该方法克服了传统蛋白质组学研究方法所存在的诸多问题，实现了质谱技术应用临床检测的飞跃[1]。通过商品化的SELDITOF技术平台，已经在膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、食管癌、结肠直肠癌[2-9]等疾病的比较蛋白质组学研究中发现了多种疾病相关的候选蛋白标志物。用高灵敏度的蛋白质芯片技术寻找新的肿瘤标志物用于早期诊断和监测治疗效果已成为临床医学研究的一个新方向。目前对大肠癌诊断模型的相关研究国内外报道不多。本研究采用SELDITOFMS技术及CM10芯片分析训练组中37例大肠癌患者和性别年龄匹配的38例正常对照血清蛋白表达谱,用ZUCI蛋白芯片数据分析系统软件包对所得到的数据进行分析，采用支持向量机方法建立了一个由6个差异蛋白组成的大肠癌血清蛋白质组图谱的诊断模型。在训练组中该模型可以明显地区分两组人群,其敏感度和特异度均为100%。在留一法交叉验证中,其敏感度和特异度分别为94.59%和97.37%。应用该诊断模型，我们对测试组的27例血清标本进行盲法检测，得到该模型对大肠癌的检出率为81.25%,排除率为100%。本研究中发现大肠癌患者的血清蛋白质谱和国内其他学者所做得大肠癌患者的血清蛋白质谱有些许差异，这是否是试验条件不同所造成的，这都有待于进一步研究。由于本研究是在相对有限的样本上进行的,因此如果以此模型用于临床检测尚需进一步扩大样本反复临床验证和完善。尽管如此, SELDITOFMS技术为大肠癌的诊断与筛查提供了一种新的简单、快速、高通量的血清学诊断方法。

　　【参考文献】

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