RPHPLC法测定温肾苏拉甫片中吗啡的含量

　　【摘要】 　　目的：以温肾苏拉甫片为研究对象，建立对罂粟壳中所含吗啡的含量测定方法。方法： 采用RPHPLC法：SHIMADZUPack VPODS 色谱柱(4.6×150 mm，5 μm)，流动相为甲醇-乙腈-0.5%醋酸铵溶液-三乙胺(12.5∶12.5∶75∶0.06)，流速1.0 ml/min，检测波长为287 nm，柱温：35℃，进样量：10 μl。结果：吗啡在21.8～436.0 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系(r=0.999 7，n=5);平均回收率低、中、高浓度分别为：96.99%、97.55%、100.17%，相应的RSD值分别为：0.52%、0.37%、0.33%(n=9)。供试液稳定性日内和日间RSD分别为：0.80%、0.89%。最小检测限为0.72 μg/ml。结论：本方法专属性强、操作简单、灵敏度高、结果准确、重现性好，可用于制剂的质量控制，同时完善并提高了原有的药品质量标准。

　　【关键词】 RP HPLC 温肾苏拉甫片 吗啡

　　Determination of morphine content in compound tablets by RPHPLC

　　YAN Huan, ZHONG Jie, YAN Ming, et al

　　(Xinjiang Institute of Materia Medica, Urumqi 830004, China)

　　Abstract: Objective: To develop an RPHPLC method for determination morphine content in compound tablets. Methods: By RPHPLC. The liquid chromatography was carried out using a SHIMADZUPack VPODS column (4.6×150 mm, 5 μm). The flow rate of the mobile phase: methanolacetonitrile 0.5% ammonium acetatetriethylamine (12.5∶12.5∶75∶0.06) was 1.0 ml/min. Detection wavelength was at 287 nm, column temperature was at 35℃, the injection volume was 10 μl. Results: The linear response range of morphine was 21.8～436.0 μg/ml (r=0.999 7, n=5). The average recovery was not less then 96.99%, RSD was less then 0.33% (n=9). The RSD for interday and intraday were all less then 0.80% (n=6). Detectable concentration limited was 0.72 μg/ml. Conclusion: The method is simple, sensitive, accurate and reproducible. It can be used in quality control of Wenshensulafu compound tablets.

　　Key words: RPHPLC; compound tablets; morphine

　　温肾苏拉甫片为新疆地方标准维药，其主要成分有中亚白及、肉豆蔻、高良姜、附子、肉豆蔻衣、肉桂、罂粟壳、西红花等[1-2]。该方的原质量标准方法简单，又因罂粟壳所含的主要生物活性成分为吗啡类生物碱，归属于麻醉药品，连续使用易产生身体依赖性，能成瘾癖，吗啡是罂粟壳中含量最大的毒性成份，致死量为100 mg，极量为30 mg。可待因是罂粟壳中另一毒性成分，仅为吗啡毒性的1/8。罂粟碱对人的致死量为100～500 mg，由此可见控制罂粟壳的毒性主要是控制吗啡的含量，这是建立吗啡的含量测定方法和规定毒限的依据。本文主要以HPLC法对吗啡及罂粟碱进行含量测定，方法简便、重现性好，结果准确可靠，与其它分析方法比照，结果甚为满意。

　　1仪器与试剂

　　仪器：LC2010C日本岛津(SHIMADZU)高效液相色谱仪(ODS柱:150 mm×4.6 mm);CLASSVP色谱工作站。温肾苏拉甫片(新疆华康药业有限责任公司提供);硫酸吗啡标准品(批号：12380103)，由中国药品生物制品检定所提供。试剂均系分析纯(西安化学试剂厂提供)。实验药材均由自治区维吾尔医医院提供。

　　2实验方法与结果

　　2.1HPLC法测定硫酸吗啡的含量与限度

　　2.1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;甲醇-乙腈-0.5%醋酸铵溶液-三乙胺(12.5∶12.5∶75∶0.06)为流动相;检测波长为287 nm。流速：1.0 ml/min。理论塔板数按硫酸吗啡峰计算应不低于3 000。

　　2.1.2对照品溶液的制备取硫酸吗啡对照品约10 mg，精密称定，置50 ml容量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1毫升含硫酸吗啡0.2 mg)。

　　2.1.3供试品溶液的制备取本品约10 g,精密称定，置具塞锥形瓶中加浓氨水20 ml,碳酸氢钠4 g,搅拌均匀，放置30 min，加入乙醚150 ml,振摇10 min，超声提取10 min，离心,浸出上清液，残渣再用乙醚超声提取两次，每次120 ml,合并提取液，水浴下挥干，残渣用无水甲醇溶解，并转移至10 ml容量瓶中，用无水甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。

　　2.1.4阴性样品溶液的制备取缺罂粟壳的阴性样品10 g，精密称定，依供试品溶液同法操作制备阴性样品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。记录色谱图，按外标法以峰面积计算硫酸吗啡的含量。色谱图见图1。

　　图1HPLC色谱图(略)

　　a: 样品溶液; b: 对照品溶液; c: 空白

　　2.2系统适用性试验理论塔板数：n= 5.54(tR/Wh/2)2=5.54(3.67/0.15)2 =3316。分离度：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)=2(3.7-3.4)/(0.15+0.4)=1.1。

　　2.3线性范围的考察精密称取硫酸吗啡对照品，加甲醇制成每毫升含吗啡0.5 mg的溶液。精密吸取储备溶液0.4、2、4、6、8 ml置10 ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度。吸取对照品溶液10 μl注入高效液相色谱仪，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线方程。在21.8～436.0 μg/ml范围内，硫酸吗啡有良好的线性关系，线性回归方程为：Y=1 417.9X+1 330.7，r=0.999 8。含量测定样品浓度与添加回收实验样品浓度均在此范围内。

　　2.4检测限和定量限的考察取硫酸吗啡对照品溶液，用甲醇依次稀释制成一系列溶液，按信噪比(S/N)为3，测得硫酸吗啡检测限为0.005 53 μg/ml;按信噪比(S/N)为10,测得硫酸吗啡定量限为0.016 6 μg/ml。

　　2.5精密度考察取同一批样品(批号：060801)制备供试品溶液1份，重复进样6次，记录硫酸吗啡峰面积，并计算出RSD为0.87%，表明仪器精密度良好。

　　2.6重复性考察取同一批样品(批号：060801)制备供试品溶液6份，按“2.1”项下方法平行制备样品溶液并测定，结果硫酸吗啡RSD为1.34%，表明本方法重复性符合分析要求。

　　2.7稳定性考察取供试品溶液在0、2、4、6、8、12、24、48、72 h分别进样测定硫酸吗啡含量,考察其72 h内稳定性。结果日内和日间RSD分别为0.80%、0.89%。其峰形和含量变化不大，表明样品溶液在72 h稳定。

　　2.8加样回收率实验精密称取供试品5 g共9份，另取0.218 mg/ml的硫酸吗啡对照品溶液5 ml置50 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，三组分别加入上述稀释的硫酸吗啡对照品溶液各1、2、3 ml，一份不加对照品溶液，依供试品溶液制备方法同法操作，滤过后，分别取上清液进样10 μl，结果见表1。

　　表1回收率结果(略)

　　2.9样品含量测定结果采用该方法对三批中试样品进行含量测定，批号为20060801、20060808、20060815的温肾苏拉甫片中硫酸吗啡的含量分别为25.54、26.08、25.65 μg/片。 吗啡既是有效成分又是毒性成份，LD50(小鼠皮下)为700 mg/kg，对人的最小致死量约为100 mg，极量为30 mg，对幼儿则要小得多，且易成瘾。本品的上限量规定参照毒、极量和常用量要求，规定为30 mg;下限量是在考虑本品实际生产过程中药材来源不同造成的误差，在含量测定10批数据的基础上下浮动20%，规定本品每片硫酸吗啡含量不小于19 μg。

　　3讨论

　　3.1色谱条件选择

　　3.1.1流动相选择依据根据文献报道[3-5]，罂粟壳含量测定，罂粟碱的HPLC色谱条件为：甲醇—0.5%醋酸铵溶液(含三乙胺0.08%)65∶35为流动相;流速：1.0 ml/min，用此流动相进行预试,吗啡的极性比罂粟碱强得多，保留时间短，主峰出峰时杂质干扰大，不适合直接测定吗啡，经适当调节流动相中有机相的比例，使有机相比例降低到35%时，吗啡对照品的峰形较好。

　　3.1.2波长选择依据硫酸吗啡的水溶液在285 nm(E值为41)处有最大吸收，在261 nm处有最小吸收;其乙醇溶液在287 nm(E值为55)波长处有最大吸收，在263 nm有最小吸收。吗啡在碱液和酸液中的吸收波长都不尽相同，在碱液中E值最大。因供试品是在甲醇中定容，所以选择287 nm为测定波长。

　　3.2供试品溶液的制备方法考察用三氯甲烷提取制得的供试品溶液，经HPLC分析，结果显示吗啡峰包含在其他生物碱峰中;用乙醚提取制得的供试品溶液结果显示，分离度达到基本要求(>1.0)，理论塔板数大于3 000,峰形稍有拖尾，适当增加流动相中三乙胺的比例(从0.08%到0.1%)加以校正。

　　3.3结论本方法专属性强、操作简单、灵敏度高、结果准确、重现性好，可用于制剂的质量控制，同时完善并提高了原有的药品质量标准。

　　【参考文献】

　　[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准(维吾尔药分册)[S].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1998:194.

　　[2]刘勇民.维吾尔药志[M].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社，1999:9.

　　[3]陈发奎.常用中草药有效成分含量测定[M].北京：人民卫生出版社，1997:264.

　　[4]郑虎占.中药现代化研究与应用[M]. 北京：学苑出版社,1998:126.

　　[5]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2005:257.