纳米生物陶瓷人工听骨周围组织生物相容性的研究

　　【摘要】 目的：评价纳米生物陶瓷(纳米羟基磷灰石复合多孔陶瓷)与皮下周围组织的生物相容性，探讨其作为经皮下植入听骨材料的可行性。方法：采用大鼠皮下植入模型。大鼠30只，随机分成6组，每组5只。将氧化铝陶瓷和纳米羟基磷灰石复合多孔陶瓷人工听骨植入大鼠背部肩胛区的左、右侧皮下组织，左侧作为对照组，右侧作为实验组。分别于术后 1、2、4、8、16、32周时处死各组实验动物,运用大体和一般组织学方法及扫描电镜动态观察材料与周围组织的生物学反应。结果：纳米羟基磷灰石复合多孔陶瓷材料与氧化铝陶瓷材料植入初始引起周围组织以嗜中性粒细胞、巨噬细胞等急性炎症细胞为主,至1周炎症反应减轻，有疏松的纤维包膜形成。2周时以淋巴细胞浸润为主,部分纤维细胞。4周时炎症反应消退，以纤维母细胞、纤维细胞为主，有少许淋巴细胞浸润。8周后纤维包膜变薄，无炎细胞浸润。结论：纳米羟基磷灰石复合多孔陶瓷材料与皮下组织有良好的生物相容性。

　　【关键词】 纳米生物陶瓷; 生物相容性; 复合人工听骨

　　The study on the cellular responses around artificial ear

　　ossicles of nano-bioactive ceramics in rats

　　WU Zhao-hong, LIU Li-zhong

　　(Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University,

　　Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: To evaluate the biocompatibility of nano-hydroxyapatite compound porous ceramic with skin tissues, and provide further experimental basis for clinical application of materials percutaneously implanted in bone by the implant test in vivo.　Methods: Thirty rats were divided in to 6 groups (5 in each group). These two kind of artificial ear ossicles were implanted in the back of rats respectively. The right back of rats implanted nano-hydroxyapatite compound porous ceramic was divided into experimental group and the left back of rats implanted alumina ceramic was control group. Each group animals executing on 1, 2, 4, 8, 16, 32 weeks after operation, investigated responses of skin tissue to materials by general and common histology. Results: Neutrophiles and macrophages predominated in two groups at the early period after implantation, which had the significant differences with control group. Inflammatory responses decreased and the layer of fibrous tissue formed on 1 week after operation. Suffusion of lymphocyte appeared and the layer of fibrous tissue became thick on 2 weeks after operation. From 4 weeks, cells around implants were mainly fibroblasts and fibrocytes. Inflammatory responses faded away and the thick layer of fibrous tissue became dense on 30 days after operation. The layer of fibrous tissue became thin and no inflammatory cell on 60 days after operation. Conclusion： Nano-hydroxyapatite compound porous ceramic has an excellent biocompatibility with around tissue.

　　Key words: biocompatibility; bioactive ceramics; composite artificial ear ossicles in rats

　　随着材料学的发展，已经制备出具有纳米结构的新型骨支架材料，如纳米羟基磷灰石复合多孔陶瓷人工听骨支架材料，该材料具有良好孔隙结构和一定强度的无机纳米多孔陶瓷支架，经反复的工艺改进得到了理化性能较好的支架材料[1]。其作为听骨的替代物已在临床上得到应用，但对其排斥反应仍有争议[2]。为了进一步研究和比较生物活性不同的材料在组织中的表现,本实验采用大鼠植入模型，分别将氧化铝(AO)和纳米羟基磷灰石(HA)复合多孔陶瓷制成的人工听骨埋植于大鼠皮下组织中，观察2种材料1~32周大体、组织病理学及超微结构变化。评价纳米HA复合多孔陶瓷人工听骨与皮下组织的生物相容性，为其在植入听泡的研究中提供实验理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 纳米羟基磷灰石复合多孔陶瓷和氧化铝陶瓷人工听骨，由新疆大学应用化学研究所提供。

　　1.2 实验动物 生后8周雌性健康Wistar 系大白鼠(新疆医科大学实验动物中心提供并饲养), 体重180~250 g，共30只，随机分为6组，每组 5 只。

　　1.3 实验方法 称重，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)进行腹腔注射麻醉，去除背部鼠毛后，碘伏术野局部消毒，铺无菌单，沿大鼠的背部肩胛区纵形切开皮肤长约0.8 mm，钝性分离皮下组织不伤及肌肉层，将AO陶瓷人工听骨植入肩胛区左侧作为对照组，纳米HA复合多孔陶瓷人工听骨植入肩胛区右侧作为实验组，切口边缘用1号丝线缝合。分别于术后1、2、4、8、16、32周观察大体变化，并采用颈椎脱臼法处死相应组动物取材。将材料及其周围0.3 cm内的组织取出放入10% 福尔马林液中固定液内固定。3 d后于显微镜下仔细剖开组织块, 细心剔除植入的人工听骨。取除人工听骨后的组织标本按常规作成 6 μm 连续切片, HE 染色。每个标本随机选出 5 枚切片于光学显微镜下观察。对围绕人工听骨周围的反应细胞进行分类计数, 并计算出所占百分比。

　　1.4 观察指标

　　1.4.1 大体观察 大鼠进食活动情况，术区切口愈合情况，有无红肿、破溃现象;肉眼观察材料周围皮肤有无坏死、脓肿及材料与周围的皮肤结合是否紧密。

　　1.4.2 组织学观察 将 5 个时间的标本用10%福尔马林液固定，纵行取材，常规梯度脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，观察不同时间材料与皮肤组织的生物学反应。

　　1.4.3 超微结构观察 对5个时间的标本进行扫描电镜的观察扫描电镜　取材料及周围组织, 10% 福尔马林固定, 修块、冷冻断裂，再固定，用30%～100%乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金镀膜，电镜观察并照相。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件包进行统计学分析，所有数据用±s表示，组间用配对t检验, 检验水准为α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 大体观察 术后1周内大鼠进食活动正常，切口及材料周围的皮肤有红肿，无分泌物，无破溃现象，材料与周围皮肤易于分离;术后2周大鼠进食活动良好，切口愈合良好，材料周围皮肤无红肿，无分泌物，无破溃现象，材料与周围皮肤较易分离;术后4周,切口Ι期愈合，材料周围皮肤无红肿，无分泌物，无破溃现象，材料与周围皮肤有疏松连接;术后 8~32周，材料周围皮肤无红肿，无分泌物，无破溃现象，材料与周围皮肤结合紧密。

　　2.2 组织学观察 2组人工听骨植入术后早期(1～2周)有相似的组织细胞反应。术后第1周有少量的淋巴细胞, 未发现有纤维母细胞或纤维细胞。周围皮肤组织内可见血管充血、点状出血，细胞反应以巨噬细胞和嗜中性粒细胞为主，少量淋巴细胞浸润，有少量纤维母细胞和纤维细胞;术后第 2周, 皮肤组织内血管充血、点状出血减轻，嗜中性粒细胞全部消失，巨噬细胞和淋巴细胞继续减少, 而纤维母细胞和纤维细胞数量则持续增加(图1)。

　　图1 植入2周血管充血减轻，浸润的中性粒细胞有所减少，淋巴细胞增多，并由少量纤维细胞 图2 植入4周时充血消退，可见少量的淋巴细胞，大量的纤维细胞和胶原纤维 图3 植入8周纤维细胞较多，包膜变薄，致密，未见中性粒细胞

　　2.3 2种人工听骨材料周围组织反应细胞数比较 仅在纳米羟基磷灰石复合多孔组的第1周标本中发现小量异物巨细胞(0.1±0.2)%。术后后期 (术后4~16周)开始,AO组中巨噬细胞和淋巴细胞持续存在,但不断减少直至接近零, 在第 16周时分别为(1.9±1.8)%和(1.8±1.1)%。纳米HA复合多孔组纤维组织增生平稳发展, 更趋成熟，在术后4周和8周的标本中巨噬细胞与异物巨细胞均已消失(图2、3，表1)。

　　2.4 扫描电镜观察 植入后 1~2 周，各组实验侧复合材料颗粒间主要少量的纤维组织(图4);8周时，实验侧各组复合材料颗粒间有大量纤维组织，排列紧密(图5);8～16周，各组实验侧新骨形成与 4周结果基本一致，但随时间延长，纤维组织逐渐转向致密(图6)。表1 2种人工听骨材料周围组织反应细胞数的比较

　　3 讨论

　　纳米HA复合多孔陶瓷属于生物活性陶瓷和纳米仿生骨，在机体内具有很高的稳定性和很好的机械强度，经测量孔隙大小为100～500 μm，孔壁为 100～300 μm，平均孔隙率为45%～55%，抗压强度为15～17 MPa，大于松质骨的强度(7.09 MPa),克服了单纯的羟基磷灰石陶瓷韧性差 ,容易发生折断和碎裂的缺点[3]。从机械性能方面考虑，纳米羟基磷灰石复合多孔陶瓷材料适合作为人工听骨的经皮下植入材料，但植入材料与组织细胞的相容性如何，是否对机体构成损害或引起毒性反应，是人们普遍关心的问题。评估一种生物材料的生物相容性,最基本的是检测其植入组织后,周围组织的炎症细胞反应和纤维包膜形成表现[4]。而移植物在组织中的稳定性又很大程度取决于植入材料和组织界面间的细胞反应[5]。一般情况下,组织对植入物的生物反应常有急、慢性炎症反应和纤维组织增生反应。体内试验和体外试验是目前评价材料生物相容性的主要手段[6]。体内植入试验是检测生物材料组织相容性的最有效方法之一，将生物材料植入动物的合适部位 (如皮下、肌肉)，在一定时期通过组织学切片观察组织的变化。

　　本研究显示,在术后第1周的细胞反应中，虽实验组的嗜中性粒细胞、巨噬细胞反应略低于对照组,但差别无统计学意义(P>0.05)。而淋巴细胞反应及第 1周的所有炎症性细胞反应,虽实验组仍低于对照组,但差异有统计学意义(P<0.05)。提示尽管材料生物相容性良好,但应正视它们在组织中仍是作为一种异物存在,而应在术后加强抗炎、抗排斥措施。植入物周围纤维包膜的形成常被认为是材料与组织之间的理想反应,是提示材料生物相容性良好的一个指标[7]。本研究从术后第1周开始就发现人工听骨周围出现薄层纤维组织,随着时间推移,纤维层越趋成熟,提示了2种人工听骨均有较理想的生物相容性,是一种良好的成形外科手术材料。然而不同的生物材料由于其物理、化学特性,表面结构,甚至材料的水溶性的不同而可能在植入组织后会有不同的组织反应,进而影响术后结果。

　　氧化铝是一种生物惰性陶瓷，它具亲水性，在各种体外、体内的实验研究中，从未观察到氧化铝分解或离子析出现象[8]。与纳米羟基磷灰石听骨在组织中的反应不同之处是，虽然氧化铝听骨周围组织的炎症细胞反应在整个实验过程中始终存在，但除了术后早期外，一直处于很低水平。

　　本研究表明扫描电镜观察2种人工听骨表面结构的不同，在颗粒大小、形状、分布和密度上均有较明显的差异。大体和组织学观察显示，在纳米羟基磷灰石复合多孔陶瓷材料植入的早期周围皮肤有炎性细胞浸润，考虑在植入的早期可能由于手术创伤引发了机体的炎性反应，因此 2～4周炎性反应逐渐消退，有纤维包膜形成并增厚，是机体对异物的保护性应答反应。8周时致密纤维包膜变薄,胞核消失,玻璃样变性，无炎性细胞，各时期材料周围均未见异物巨噬细胞出现，表明材料中无毒性物质渗出，性能稳定。在植入32周时，重新观察到淋巴细胞和巨噬细胞活动，其原因可能与材料的化学组成和表面生物降解有关。实验结果提示纳米羟基磷灰石复合多孔陶瓷材料为皮下组织所接受，不发生异物反应，材料与皮下组织之间仅形成一种较薄的纤维包膜[9]，且纤维包膜无明显的血管组织和炎性细胞浸润，表明其与皮肤组织有良好的生物相容性[10]。通过本实验证明，机械性能优异的纳米羟基磷灰石复合多孔陶瓷材料具有良好的生物相容性，因而其仍是中耳手术中良好的生物替代材料。

　　【参考文献】

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　　[10] 张龙城,宋为明,唐增福,等.BMP-HA人工听骨在显微外科鼓室成形术中的应用[J].中华显微外科杂志,2005,28(1):30-31.