糖康对糖尿病大鼠视网膜组织中NFκB信号通路的影响

　　【摘要】 目的从视网膜微血管形态学和细胞分子两个水平，观察糖康对糖尿病大鼠视网膜病变的影响并探讨其具体作用机制，为糖康防治糖尿病视网膜病变提供理论依据。方法采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)复制糖尿病模型并随机分为正常组、模型组、糖康高、中和低剂量组和达纳康组，每日灌胃，定期检测大鼠体重和非空腹血糖。第12周末，消化铺片法观察视网膜微血管病理和形态学改变。Western blot检测NFκB亚基P65在细胞核内的含量。RTPCR检测其下游靶基因Bax和IL1β的表达水平。结果与正常组比较，模型组大鼠视网膜呈现较多的无细胞毛细血管条索数(约为正常组的12.16倍)。与模型组比较，各治疗组无细胞毛细血管条索数明显减少(P<0.01)。与正常对照组比较，模型组NFκB蛋白表达明显上调(P<0.01)，各治疗组NFκBP65蛋白在视网膜组织的表达不同程度降低，以糖康高剂量组最为显著。与正常组比较,模型组大鼠视网膜Bax和IL1β的mRNA表达明显上调(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组大鼠视网膜Bax和IL1β的mRNA表达均不同程度降低，以糖康高剂量组最为显著。结论糖康能够明显抑制糖尿病大鼠视网膜组织NFκB活性及其下游靶基因Bax和IL1β的表达水平，通过多途径、多靶点拮抗视网膜细胞凋亡和炎症反应，保护视网膜组织，延缓了糖尿病视网膜病变的发生、发展。

　　【关键词】 糖康; 糖尿病视网膜病变; 细胞凋亡; 炎症反应

　　Effects of Tangkang on nuclear facterκB pathway in retina of diabetic rats

　　SUN Yuke， SHI Qinghua， Marzia·Daniar， et al

　　(College of Agriculture，Xinjiang Agriculture University， Urumqi 830052， China)

　　Abstract: ObjectiveTo investigate the effects of Tangkang on rats with diabetic retinopathy and further elucidate the mechanism, in order to provide the experimental basis for Tangkang preventing and curing diabetic retinopathy. MethodsThe normal Wistar rats were given streptozotocin (STZ) in intraperitoneal injection to induce the diabetic rats model. 75 rats were divided into 6 groups, including normal group, modeling group, three Tangkang treatment groups (high, median and low dosage) and Danakang group. The body weight and non fasting blood glucose of all experimental groups were tested every week. After 12 weeks,retinal vascular preparations were performed by trypsin digestion to observe the histopathologic alternations of retinal microvascular; Western blot were used to detect the protein expression of NFκBP65, the mRNA expression of Bax and IL1β in retina of all experimental groups were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR). ResultsCompared with the normal group, the numbers of acllular capillaries were significantly decreased (P<0.01), in all treated groups, and the high dosage of group was the most significant. The results of Western blot showed that the protein expression of NFκBP65 in retinal tissue of model group was increased markly compared with agematched normal control group (P<0.01). All treatment groups showed that the protein expression of NFκBP65 was inhibited.Compared with agematched normal control group,the mRNA expression of IL1β and Bax were increased in the retina of rats of modeling group (P<0.01).All treatment groups showed that the mRNA expression of IL1β and Bax were inhibited. ConclusionTangkang could inhibit the protein expression of NFκBP65 and mRNA expression of IL1β and Bax, and the development of histopathology in the retina of diabetic rats, showed protective role to the microcapillary in the retina of diabetic rats.

　　Key words: tangkang; diabetic retinopathy; apoptosis; inflammatory

　　糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)最为常见的微血管并发症之一，其发病率在我国成升高趋势。NFκB是细胞内一类重要的核转录因子，它的活化与DR的发生、发展关系密切。NFκB可被高糖和终末糖基化产物(Advanced glycation end products，AGEs)导致的氧化应激激活[1-2]。NFκB的激活参与细胞内多种细胞因子及炎性介质的转录过程，如血管内皮生长因子(VEGF)、单核细胞趋化因子(MCP1)、促凋亡蛋白Bax、内皮细胞粘附分子1(ICAM1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子α和IL1β等，其最终可影响血管系统的许多功能，包括视网膜血液动力学改变、白细胞黏附、细胞增殖、细胞外基质的调节、内皮细胞的的渗透性和血管发生等。运用现代医学方法和现代医学知识结合传统医学理论寻找治疗DR的有效方法是目前研究的新方向和趋势。糖康是运用传统医学理论和临床经验拟定复方而研制的制剂，经临床使用，疗效较好。为探讨其作用机制，本实验采用腹腔注射链脲佐菌素复制糖尿病模型，Western blot在蛋白水平上检测NFκB亚基P65在视网膜组织细胞核内的含量。半定量RTPCR检测其上、下游靶基因IL1β和Bax的表达水平，从分子水平探讨糖康对DR的干预机制，探索其对糖尿病大鼠视网膜病变的预防和治疗作用，现报道如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　动物

　　SPF纯种雄性Wistar大鼠，体重(200±20)g(购自新疆医科大学实验动物中心，医动字：第16003号)。饲养环境为光照12 h/d，标准饲料喂养，不限饮水。

　　1.2　药物

　　糖康由新疆医科大学基础医学院生化教研室提供，由黄芪、葛根、山药、枸杞和红花等组成。用旋转蒸发仪煎煮，按人与大鼠用药剂量换算公式计算出高、中和低剂量;达纳康由博福益普生(天津)制药有限公司生产(产品批号：T010)，灌胃时用生理盐水配成所需浓度的混悬液。

　　1.3　仪器与试剂

　　电泳仪及电转槽(BioRad)，分光光度计(LabTech)，高速低温离心机(Eppendorf)，血糖仪及配套试纸(日本京都)，链脲佐菌素(Sigma)，NFκB、IL1β、βactin兔多克隆抗体和辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG(北京博士德)，PVDF膜(Millipore)、ECL化学发光试剂盒(Merck)、彩虹预染蛋白质分子量标准(Bio Basic Inc.)。琼脂糖凝胶电泳仪(北京市六一仪器厂)，凝胶图像分析系统(BioRad)，PCR仪(BioRad)、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (K1621，Fermentas)、DNA Marker(百泰克生物)、DNA合成引物来自生工生物工程(上海)有限公司。

　　1.4　方法

　　1.4.1　模型的建立

　　Wistar大鼠75只，适应性饲养1周后，其中10只作为正常对照组标准饲料喂养，另60只禁食12 h后，按50 mg/kg向左下腹腔注射1%链脲佐菌素溶液制备糖尿病模型，正常组注射等剂量的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液。注射72 h后检测大鼠尾静脉非空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L定义为糖尿病大鼠。

　　1.4.2　分组及给药

　　造模1周后开始计算病程并开始给药。取成模大鼠60只按体重、血糖水平随机分为5组:糖康胶囊高、中和低剂量组，模型组(等量生理盐水)、达纳康组，加前述正常组共6组。各组于每日中午14时灌胃，1次/d，连续给药3个月。每周检测大鼠体重，以确定给药量。

　　1.4.3　取材

　　末次给药后各组大鼠禁食水12 h,乙醚麻醉，摘除大鼠眼球，左眼置于10%福尔马林溶液中固定用于视网膜微血管病理和形态学观察，右眼立即于冰浴条件下钝性分离视网膜，于液氮中速冻，-80℃冰箱冻存。

　　1.4.4　视网膜毛细血管消化铺片的制备

　　将大鼠眼球置于10%福尔马林溶液中，4℃固定24 h以上。充分水洗后，沿锯齿缘环形剪开眼球，去除眼前节。在水中分离视网膜，平均分成6份，入3%胰蛋白酶3℃消化3 h，定期观察。见组织崩解后，将视网膜移至蒸馏水中轻轻漂洗，洗去残留的视网膜神经成分，在显微镜下观察到一层薄的半透明血管网，将消化好的视网膜裱贴于洁净的载玻片上，自然干燥，行PAS和苏木精染色，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，生物显微镜下观察并计数无细胞毛细血管条索数。

　　1.4.5　Western blot检测

　　P65蛋白含量从-80℃冰箱取出冻存的视网膜组织，迅速提取核蛋白。50 μg蛋白12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。30 V、4℃电转移12 h至NC膜上。5%脱脂奶粉封闭24 h;一抗1∶600，4℃孵育24 h;二抗1∶6 000，4℃孵育24 h。以βactin为内参照，化学发光法显影，凝胶成像仪成像，凝胶分析系统观察拍照、分析。

　　1.4.6　半定量RTPCR检测

　　Bax和IL1β转录水平从-80℃冰箱取出冻存的视网膜组织，用Trizol提取视网膜总RNA，利用RTPCR逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。再以cDNA为模版，PCR扩增Bax和IL1β基因，以βactin为内参基因。βactin：上游5′CAAGGTCAT CCATGACAACTTTG 3′，下游5′GTCCACCACCCTG TTGCTGTAG 3′，产物长度496 bp。Bax：上游5′CATCCAGGATCGAGCAGGGCGAAT 3′，下游：5′CAT CTTCTTCCAGATGGTGAGCGA 3′，产物长度484 bp。IL1β上游：5′GCTGAAAGCTCTCCACCTCAA 3′,下游5′GGTGGGT GTGCCGTCTTTCAT 3′，产物长度163 bp。扩增条件：94℃，3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶分析系统观察拍照、分析。

　　1.5　统计学处理

　　使用SPSS16.0统计软件对实验数据进行处理，结果以(±s)表示。组间两两比较作两样本均数的t检验，多组间比较采用单因素方差分析F检验，检验水准α=0.05。

　　2　结果

　　2.1　各组大鼠视网膜微血管形态学观察正常组大鼠视网膜毛细血管排列规则，管径粗细均一;周细胞位于毛细血管管腔外侧，核较小，染色较深，多成球形或三角形;内皮细胞一般位于毛细血管中央，核呈椭圆形，较大，染色较浅，与血管平行;毛细血管管腔通畅，无细胞栓塞，偶见无细胞毛细血管。与正常组比较，模型组大鼠视网膜毛细血管排列紊乱，血管迂曲，管径粗细不一;周细胞数目减少，细胞核肿胀，体积增大，染色浅;毛细血管管腔闭锁，呈现较多的无细胞毛细血管条索数(约为正常组的12.16倍)。糖康高、中剂量组毛细血管行走尚规则，周细胞肿胀不明显，未见血管形态异常改变;糖康低剂量组和达纳康组周细胞肿胀较明显，毛细血管迁曲，管径粗细不一，呈现较多的无细胞毛细血管条索数(图1、2)。

　　2.2　各组大鼠视网膜组织中NFκBP65蛋白表达水平比较采用BioRad Quantity One图像分析软件测算出NFκBP65蛋白表达条带的光密度值，将其与同一样品内参βactin蛋白表达条带的光密度值比较，进行量化分析。结果发现：正常组大鼠视网膜组织NFκB有一定表达;与正常对照组比较，模型组NFκBP65蛋白表达明显上调(P<0.01);糖康干预组，NFκBP65蛋白在视网膜组织的表达不同程度降低，接近于正常组(图3、4)。

　　2.3　各组大鼠视网膜组织中Bax和IL1β的mRNA表达水平比较取各组大鼠的βactin、Bax和IL1β mRNA的PCR产物5 μl上样于1.5%琼脂糖凝胶中，电压80 V，电泳30 min，凝胶成像仪成像。采用BioRad Quantity One图像分析软件测算出各目标条带的光密度值，然后将Bax和IL1β的目标表达条带的光密度值与同一样品内参βactin的表达条带的光密度值比较，计算出目的条带的相对表达量，进行量化分析。结果发现：正常组大鼠视网膜有Bax mRNA的表达。与正常组相比，模型组大鼠视网膜Bax mRNA的表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组大鼠视网膜Bax mRNA的表达均不同程度降低，以糖康高剂量组最为显著(图5b、6a)。正常组大鼠视网膜有IL1β mRNA的表达，与正常组相比，模型组大鼠视网膜IL1β mRNA的表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较，糖康高、中剂量组IL1β mRNA的表达水平明显降低。糖康低剂量组和达纳康组IL1β mRNA的表达水平较模型组有所降低，但其表达仍明显高于正常组(图5c、6b)。

　　3　讨论

　　在DR早期，视网膜毛细血管细胞血管周细胞凋亡与NFκB的激活有关，从而导致大量的无细胞毛细血管和周细胞鬼影[3]。用高糖培养的视网膜周细胞，其促凋亡蛋白Bax和肿瘤坏死因子α的表达水平明显增加，采用NFκB的抑制剂则抑制了它们的表达[4]。促凋亡蛋白Bax可通过进入线粒体，诱导线粒体通透性的改变[5]。线粒体是活性氧产生的主要部位，其在调节细胞凋亡过程中起着关键作用。活性氧能触发线粒体释放细胞色素C和凋亡诱导因子，增加的脂质过氧化本身能够增加线粒体膜的通透性诱发细胞凋亡[6]。Bax主要在视网膜神经细胞和血管细胞表达，凋亡相关基因BCL2和Bax在早期DM大鼠视网膜血管和神经细胞的表达随病程的进展逐渐增强，二者在糖尿病视网膜细胞凋亡中起到重要作用[7]。研究认为，NFκB的激活与Bax的过表达呈现共区域化，二者主要在视网膜周细胞表达[8]，提示NFκB的激活与Bax的表达水平的升高与视网膜微血管周细胞凋亡有关。本研究结果显示，在DR早期Bax即被激活，模型组大鼠视网膜组织Bax mRNA的表达水平面明显升高，模型组大鼠视网膜毛细血管周细胞核肿胀，体积明显增大，无细胞毛细血管条索数明显增多，提示细胞凋亡通路被激活。糖康干预3个月后，明显抑制了糖尿病诱发的视网膜微血管细胞的凋亡和DR早期损害的发展，包括无细胞毛细血管和周细胞鬼影的增加;糖康高剂量组Bax mRNA的表达水平明显降低，与NFκB的P65表达水平成正相关。提示糖康可能通过抑制NFκBP65表达，减少Bax基因转录水平，从而拮抗细胞凋亡，保护糖尿病大鼠视网膜微血管，进而延缓了DR的发生发展。在DM大鼠模型中，观察到早期促炎症改变，包括无细胞毛细血管灌注、缺血及大量血栓的形成[9-10]。在糖尿病状态下，视网膜IL1β的表达水平明显升高，给药抗氧化剂和抗炎药阿司匹林抑制了IL1β的表达[11]。IL1β能诱导NFκB的激活介导细胞内多个基因的表达如：aspase3和iNOS[12]。iNOS的过表达使NO产生增多，NO可与超氧阴离子反应生成毒性更强的过氧化亚硝酸盐。研究发现，2型糖尿病病人体内IL1β水平与对照组相比明显升高，单核细胞可通过多种机制释放大量的IL1β。Kowluru等[11]向玻璃体内注射IL1β，可增加视网膜毛细血管细胞8OHdG(氧化应激标志物)的表达水平以及NO的产生，而且激活了NFκB。另外，病程2个月的糖尿病鼠增加了视网膜IL1β表达水平，应用抗氧化剂抑制了IL1β的增加。提示IL1β表达水平的升高与氧化应激以及NFκB的激活有关。IL1β本身能触发信号级联，导致线粒体ROS过量产生。炎症因子触发的氧化应激过程可激活NFκB信号通路。本研究结果显示，糖康可显著下调L1β mRNA表达水平，从而抑制了NFκB信号通路的激活，具有一定的抗炎、抗氧化的作用，这也可能是糖康防治DR的可能机制之一。综上所述，糖康对DM大鼠视网膜组织中的NFκB活性有一定的影响，抑制其表达可抑制炎性和凋亡相关基因的表达，揭示其发挥作用的关键可能是通过多途径、多靶点拮抗视网膜细胞凋亡及炎症反应，从而保护视网膜组织，延缓糖尿病视网膜病变的发生、发展。

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