2种PCR方法检测宫颈病变细胞中HPV16型基因

　　【摘要】 目的探讨荧光定量聚合酶链(Realtime fluorescent quantitative PCR , RTPCR)方法与传统聚合酶链反应(传统PCR)方法检测宫颈病变组织DNA中人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus，HPVl6)基因的异同。方法143例(其中维吾尔族标本65例，汉族标本78例)宫颈病变组织样本，均经甲醛固定石蜡包埋处理。样本分为维、汉2组，对所有样本进行DNA提取，后将DNA样本均分为2份。运用传统PCR和RTPCR 2种方法检测DNA样本中的HPV16基因，比较其检出率的异同。结果78例汉族妇女宫颈病变组织DNA样本中，传统PCR方法和RTPCR方法对HPV16基因型的检出率分别为51.28%和15.38%，差异有统计学意义(χ2=21.778，P<0.05);65例维吾尔族妇女宫颈病变组织DNA样本中，传统PCR方法和RTPCR方法对HPV16基因型的检出率分别为61.54%和18.46%，差异有统计学意义(χ2=19.184，P<0.05)。结论无论是汉族还是维吾尔族，传统PCR方法对HPV16病毒的检出率均高于RTPCR方法，因此在临床可以推广简便经济的传统PCR方法检测高危型HPV16，用于防治宫颈癌。

　　【关键词】 宫颈病变; RTPCR; HPV16

　　Detected the human papilloma virus (HPV) type 16 in cervical cancer tissue using two methods

　　RONG Xiaoling, Haimiti·Abudulimu, CHEN Rong

　　(Department of Histology and Embryology, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract：ObjectiveTo study the result about using conventional PCR and reverse transcription PCR (RTPCR) to detected human papilloma virus (HPV) type 16 in cervical cancer tissue. MethodsOne hundred and forty three DNA specimens,including 65 cases of Uygur and 78 cases of Han nationality) were extracted from formalinfixed, paraffinembedded specimens of cervical cancer， cervical intraepithelial neoplasia and cervicitis tissue. Then used the matchedpairs design to research HPV16 infection in these specimens with two methods (conventional PCR and RTPCR). ResultsThe detection results with been statistical analysis showed: The HPV16 genotypes were detected with two methods (conventional PCR and RTPCR) in 78 DNA samples, which gained from in cervical cancer tissues in Han women, arrived the detection rates with using two methods (conventional PCR and RTPCR) of HPV16 were 51.28% and 15.38% (P<0.05). Also in Uygur women′s 65 DNA specimens, we found the same result. The detection rates with using two methods (conventional PCR and RTPCR) of HPV16 were 61.54% (n=65) and 18.46% (P<0.05). ConclusionNo matter in Han or Uygur nationalities, the detection rate with using conventional PCR is higher than using RTPCR. So checking out above all experiment result, may make conventional PCR detect the HPV16 in clinical diagnosis to clinical diagnosis cervical cancer.

　　Key words: cervical cancer; reverse transcription PCR (RTPCR); human papilloma virus (HPV) 16

　　据WHO报道，每年全世界约有50万左右的宫颈癌新发病例[1]，其中28%发生在我国，居我国妇女恶性肿瘤第1位，维吾尔族妇女宫颈癌发病率居首位(17.27/10万)[2]。人乳头状瘤病毒(human papillomaviru，HPV)感染是宫颈癌的主要病因[3]。 HPV是一种双链闭环的DNA病毒，具有特异性嗜上皮性。迄今为止，世界上已发现的HPV已有200余种,特别是HPV16型被认为是该肿瘤的主要病因，故对HPV16感染的检测便成为预防宫颈癌的关键之一。但因以往对HPV感染的检测技术操作过于繁琐，结果可重复性也较差，难以用于临床日常工作。高危型HPV持续感染使CINⅢ持续发展，同时HPV的感染使宫颈癌的相对危险性增加了250倍[4]。鉴于HPV高危组中，致癌作用最强的是HPV16型[5]，因此在宫颈有病变的患者进行常规检查过程中，运用何种方法能够最准确、最经济、最迅速的检测出HPV16型基因的感染情况是非常重要的。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本收集

　　样本来源于2001～2007年新疆医科大学第一附属医院、喀什地区人民医院、和田地区人民医院、阿克苏地区农一师医院病理科档案中的甲醛固定石蜡包埋组织(Formalin Fixed and paraffin embedded tissues, FFPET)，共计143例(其中维吾尔族标本65例，汉族标本78例)，包括宫颈癌、宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈炎组织。

　　1.2　方法

　　1.2.1　宫颈病变细胞DNA的提取、模板纯化及PCR扩增筛选合格的DNA模板从10%甲醛固定石蜡包埋的组织中提取DNA[5-6]。后将稀释模板放入UNIQ10柱中纯化，8 000 r/min离心1 min，取过滤液进行PCR扩增(扩增条件为：94℃预变性5 min，1个循环，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环，72℃总延伸5 min，4℃保存[4])。

　　1.2.2　PCR 扩增HPV通用引物GP5/6条件为：94℃变性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次，4℃保存[7]。

　　1.2.3　PCR 扩增HPV16条件为：95℃预变性3 min，循环1次，95℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸25 s循环40次，72℃延伸7 min，循环1次，4℃保存[8]。

　　1.2.4　荧光定量PCR扩增HPV16条件为：95℃预变性5 min，循环1次，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，循环35次，72℃延伸7 min，循环1次，4℃保存[9]。以上总反应体积为50 μl(TaKaRa Ex Taq(5 U/μl) 0.3 μl、10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)5 μl、dNTP Mixture 4 μl、模板DNA 5 μl、引物1、2(20 pmol/ml)2 μl，加DEPC处理水至50 μl)。

　　2　结果

　　2.1　PCR检测HPV16基因结果显示M显示为标准对照(100 bp DNA Ladder Marker),1号显示为阴性对照，2号显示为阳性对照(已扩阳性HPV16 DNA模板，96 bp)。此外，3～13号条带显示为以HPV16为引物的样本DNA经PCR扩增产物，其中6、8、13号显示为阳性(图1)。

　　2.2　传统PCR与RTPCR方法对不同民族宫颈病变组织DNA中HPV16型基因的检测结果

　　在汉族妇女宫颈病变组织的DNA样本组中，传统PCR方法和RTPCR方法对HPV16型基因的检出率分别是51.28%和15.38%，差异有统计学意义(χ2=21.778,P<0.05)(表1)。在维吾尔族妇女宫颈病变细胞的DNA样本组中，传统PCR方法和RTPCR方法对HPV16型基因的检出率分别是61.54%和18.46%，差异有统计学意义(χ2=19.184,P<0.05)(表2)。表1　2种PCR方法对汉族妇女宫颈病变组织DNA，表2　2种PCR方法对维吾尔族妇女宫颈病变组织DNA(略)。

　　3　讨论

　　PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术,具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。PCR的扩增结果取决于多种因素，如引物设计、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶活性以及DNA提取来源等。由于PCR反应混合物中除模板、引物外其他成分基本上是成品，因此如何用现有的实验标本获得适合于PCR反应的模板DNA及合理的引物设计十分重要[10]。本实验从汉族妇女宫颈病变组织中提取的78例DNA样本中，传统PCR方法和RTPCR方法对HPV16基因型的检出率分别为51.28%和15.38%，差异有统计学意义(P<0.05)。在从维吾尔族妇女宫颈病变组织中提取的65例DNA样本中，传统PCR方法和RTPCR方法对HPV16基因型的检出率分别为61.54%和18.46%，差异有统计学意义(P<0.05)。显示传统PCR方法对HPV16型基因的检出率明显高于RTPCR方法，此结果与Biedermann等[8]的研究结果相似。这很可能是由于本实验在DNA提取和传统PCR检测的整个实验过程中，对实验步骤做相关优化处理的结果。为了得到更纯的DNA样本，保证PCR检测的精确度，本实验步骤进行了以下处理：(1)提取DNA的整个实验过程仅在2个EP管中完成，利用改进的酚氯仿抽提法提取基因组DNA，即使用酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1的混合液，弥补了以前繁琐而费力的酚-氯仿反复抽提DNA，避免了由此造成的DNA的丢失和污染，保证了PCR反应的质量。(2)为了达到充分消化组织的目的，蛋白酶K的浓度选择为20 mg/ml，消化时间选择为24 h。PCR反应中的循环次数为35次[11]，以使DNA模板稳定且重复性好。(3)通过HPV通用引物PCR待测基因片断使信息放大，再引用特异性引物PCR具体分型，即用HPV通用引物GP5/6广谱扩增HPV基因片断，再用HPV16特异性引物扩增HPV16基因片段。虽然RTPCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，但其本身与传统的PCR技术相比，还存在不足之处。从样本的准备到扩增，再到定量，实验中的每个方面都与实验的重复性息息相关。除了加样的准确性和实验所选用的仪器固定参数的限制之外，PCR反应扩增的效率也会在一定程度上影响到目的基因在单位时间内的产量，从而影响到结果的稳定。RTPCR可以检测出单细胞水平的基因组DNA[12]，但是在大多数情况下，对基因组DNA而言，它的最低检出限一般在pg到fg级，对于病毒、质粒而言，其检出限一般在102~103拷贝数以上[13]。但由于RTPCR在整个检测过程中运用了封闭式检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小，这也可能是影响本实验结果的因素之一。目前RTPCR实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。综上所述，无论在临床检查辅助诊断，还是在基础实验研究中，只要求定性，而不需要定量时，可以选择经济、简便、快速的传统PCR方法进行研究。而在同时要求定性、定量的情况下，建议可以选择RTPCR方法进行研究。

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