裸质粒转染细胞的可行性研究

　　【摘要】 目的 验证裸质粒转染细胞的可行性与合适的转染的条件。方法 取PCDNA3.1(+)EGFP与pEGFPC3两种绿色荧光载体，以不同的浓度转染细胞，观察转染效果，选取转染效果较好的质粒浓度进行动物实验，进一步验证其效果。结果 真核载体可直接通过细胞膜进入细胞并表达绿色荧光。结论 真核载体可直接通过细胞膜进入细胞，但其通过效率与自身的结构与质粒浓度有一定关系。

　　【关键词】 绿色荧光蛋白;真核载体;基因表达

　　Feasibile Study of Naked Plasmid Transfection Cell

　　HU Yile，CAO Jing，ZANG Weidong，et al

　　(Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003,China)

　　Abstract:Objective To test the feasible study of naked plasmid transfection cell and suitable transfecting condition. Methods Diverse concentration plasmids are transfected to NIH3T3cells and then selecting suitable concentration plasmid to inject cavitas subarachnoidealis of rats.Detect their biologic effect and expressive locations by fluorescent microscope. Results Initial eukaryotic vector can transfect cell envelopment and express green fluorescent protein. Conclusion Eukaryotic vector can transfect cell envelope directly, but its efficiency is related to plasmid’s construction and concentration.

　　Key words:green fluorescent protein; eukaryotic vector; genetic expression

　　基因研究中常用的载体有病毒载体与非病毒载体，病毒载体具有穿过细胞膜与整合入宿主染色体并表达的特性[1]，在基因的诊断与治疗研究中广为应用，但其存在自身免疫原性和造成细胞病理改变等缺点[2]。以真核载体为代表的非病毒载体以其低毒、低免疫反应、制备方便、便于保存和检验等优势越来越多地被应用，目前大多数文献报道真核质粒不能直接通过细胞膜[3]，所以在真核载体转染细胞时多采用脂质体包裹、电转、基因枪等方法。作者在绿色荧光真核载体脂质体转染实验中，发现没有脂质体包裹的对照组细胞中也有少量绿色荧光的表达。为证明没有其他方法介导的裸质粒能否转染细胞，以PCDNA3.1(+)EGFP与pEGFPC3两种绿色荧光载体直接对NIH3T3细胞的转染做可行性实验。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　胎牛血清、DMEM培养基购自Hyclone公司;PCDNA3.1(+)EGFP与pEGFPC3两种绿色荧光载体以及NIH3T3细胞由郑州大学基础医学院人体解剖学实验室保存。6孔细胞培养板、冻存管购自上海宝生物公司;成年SD大鼠购自郑州大学动物中心。

　　1.2 转染前细胞准备

　　为获取理想的转染效果，需将液氮中冻存的NIH3T3细胞快速复苏并传3代，待细胞恢复正常活力后转入6孔细胞培养板继续培养，等细胞生长达70%时将其分为6组，每组6孔细胞准备转染。

　　1.3 质粒的转染

　　取去内毒素的PCDNA3.1(+)EGFP与pEGFPC3质粒按2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L、24 mg/L、32 mg/L质粒浓度分别加入各组培养孔中(其中第4 mg/L为6孔板脂质体转染要求浓度)，37℃ 5%CO2培养箱中培养24 h后更换培养液继续培养。

　　1.4 阳性细胞的观察与统计

　　培养48 h后在倒置荧光显微镜下观察转染效果，每孔在40倍视野下随即选取6个视野，记录每个视野中显示绿色荧光的阳性细胞的数量，取均数进行统计学分析。

　　1.5 大鼠蛛网膜下腔转染试验

　　取转染效果好的质粒及合适的浓度做动物实验，将其注入大鼠蛛网膜下腔，48 h后取大鼠硬脊膜观察是否有绿色荧光的表达，以观察裸质粒转染的可行性。

　　2 结果

　　2.1 细胞转染结果

　　转染后48 h在倒置荧光显微镜下可见阳性细胞数量随质粒浓度的提高而增加(见图1)，且PCDNA3.1(+)EGFP转然效果好于pEGFPC3。2.2 各组阳性细胞均数分析 在 16 mg/L浓度下阳性细胞最多，在 24 mg/L与32 mg/L 浓度下阳性细胞无明显增加(见图2)且细胞生长缓慢。

　　2.3 动物实验结果

　　大鼠蛛网膜下腔注射PCDNA3.1(+)EGFP质粒48 h后取大鼠硬脊膜荧光显微镜下观察，见硬脊膜上皮细胞内有绿色荧光表达(见图3)表明PCDNA3.1(+)EGFP质粒已被大鼠硬脊膜上皮细胞摄取并表达绿色荧光，证明裸质粒直接转染机体细胞是可行的。

　　3 讨论

　　基因治疗由Anderson在20世纪80年代初首先提出, 是在分子生物学、细胞生物学、病毒学的基础上建立起来的一项新技术，利用该技术可将人或动物的正常基因或有治疗作用的基因，通过一定方式转入人体靶细胞内表达以纠正基因缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的，1990年在美国成功进行了腺苷脱氢酶缺陷患儿的人体基因治疗。目前基因治疗中常用的有基因置换、基因修复、基因修饰、基因失活、免疫调节等几种，将含有新构建的目的基因转入细胞，使其稳定表达是基因治疗的基础。常用的载体包括病毒载体与真核载体。病毒载体虽具有良好的细胞膜通透性与基因整合性，但其自身免疫原性和造成细胞病理改变的缺点限制了其在临床上的应用;真核载体具有低毒低免疫等优点，目前大多文献报道认为，真核载体直接转染率低，需要采用脂质体介导、电转、基因枪等技术，操作复杂且临床实用性差。

　　本试验中通过体外NIH3T3细胞转染结果与大鼠蛛网膜下腔注射PCDNA3.1(+)EGFP质粒结果表明，真核载体可直接通过细胞膜进入细胞并在细胞内表达。体外NIH3T3细胞转染结果表明其通过效率与真核载体自身的结构有一定关系，PCDNA3.1(+)EGFP通过细胞膜的能力明显好于pEGFPC3，适当提高质粒浓度可提高体外培养细胞的细胞膜的通过率，但质粒浓度过高时转染率没有明显增高且影响细胞的正常生长。另外在试验操作中，质粒浓度的提高将增加质粒提取与去除内毒素的难度，不利于操作。大鼠蛛网膜下腔注射PCDNA3.1(+)EGFP质粒48 h后，在大鼠蛛网膜下腔上皮细胞上观察到绿色荧光也证明，质粒能被大鼠硬脊膜上皮细胞摄取并表达绿色荧光蛋白，在基因治疗中直接注射裸质粒的方法是可行的。

　　【参考文献】

　　[1]Lee ES,Kim D,Youn YS,et al.A virusmimetic nanogel vehicle[J].Angew Chem Int Ed Engl,2008,47(13):2418-2421.

　　[2] He Y,Munn D,Falo LD.Recombinant lentivector as a genetic immunization vehicle for antitumor immunity[J].Expert Rev Vaccines,2007,6(6):913-924.

　　[3] Mata M,Hao S,Fink DJ.Gene therapy directed at the neuroimmune component of chronic pain with particular attention to the role of TNF alpha.Neurosci Lett [J].2008,437(3):209-213.